Primer-Free Selezione aptamero utilizzando una libreria di DNA casuale

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare abers da una libreria casuale, che si legano specificamente a una proteina bersaglio, in questo caso la proteina S 100 B. Ciò viene ottenuto innanzitutto digerendo la libreria con un enzima di restrizione per liberare sequenze casuali dalle sequenze fisse dei primer laterali. Il secondo passaggio della procedura consiste nel legare le sequenze della libreria casuale alla proteina S 100 B purificata e recuperarle.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel ricongiungere le sequenze legate con le sequenze di primer fissate mediante ibridazione e ligazione. L'ultimo passaggio della procedura è la trascrizione dei prodotti ligati per consentire la ri-amplificazione mediante R-T-P-C-R del pool legato di aber selezionati, seguita da ulteriori cicli di questa procedura di selezione. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano un legame specifico degli aber selezionati alla proteina S 100 B.

Ad esempio, qui vengono eseguiti saggistica di legame a sandwich utilizzando microarray e saggistica con secondi anticorpi marcati fluorescentemente vengono inoltre eseguiti utilizzando nanofili funzionalizzati e secondi anticorpi accoppiati a nanoparticelle d'oro di 15 nanometri. Oggi illustreremo una procedura per la selezione di sequenze ottimali, che si legano alla proteina S hundred B, a partire da una libreria casuale di sequenze D. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per diverse finalità, tra cui lo sviluppo di una piattaforma sensoristica per la rilevazione precoce del cancro.

Iniziamo. Per iniziare questa procedura, generare una libreria di DNA priva di primer o PF come descritto in precedenza. La scissione della libreria di DNA a doppio filamento seguita da purificazione su gel con un gel di poliacrilammide denaturante al 10% produrrà un frammento di 32 nucleotidi con fosfato in posizione cinque prime in 30 cc e un frammento di 30 nucleotidi con fosfato in posizione cinque prime in 30, indicati rispettivamente come frammento 32 più e frammento 30 più.

Il frammento 32 più contiene il dominio casuale di 30 nucleotidi con la sequenza minima di collegamento CC all'estremità tre prime, mentre il frammento 30 più consiste soltanto della sequenza del dominio casuale di 30 nucleotidi. Per preparare i frammenti di DNA della libreria PF per la selezione di aptr, risospendere ciascuno dei frammenti 32 più e 30 più in 40 microlitri di 20 milli tris, HCL pH 7,4. Successivamente, riscaldare i campioni per tre minuti a 85 gradi Celsius dopo l'incubazione.

Raffreddare i campioni per tre minuti in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere 760 microlitri di tampone di selezione e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, mantenere il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, far passare la soluzione attraverso una colonna contenente perle di agarosio con nichel-NTA precedentemente lavate con tampone di selezione.

Per rimuovere il DNA non specifico, raccogliere i frammenti di DNA della libreria PF che non si legano alla colonna e metterli da parte per un uso successivo. Per preparare le perle legate a S 100 B, centrifugare innanzitutto 400 microlitri di perle di NDA nickel per tre secondi in una microcentrifuga e scartare il soprannatante. Quindi lavare le perle con 400 microlitri di buffer di legame, pipettando delicatamente per cinque volte.

Quindi centrifugare le perle e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione. Lavare due volte.

Successivamente, passare la proteina purificata in precedenza con marcatore di istidina attraverso le perle. Qui, viene utilizzata la proteina B legante del calcio S100 umana; pipettare delicatamente la soluzione su e giù cinque volte ogni tre minuti per un totale di 15 minuti.

Dopo 15 minuti, centrifugare per far sedimentare le perle e scartare il soprannatante. Infine, lavare le perle a cui è legato S 100 B con 400 microlitri di buffer di selezione, pipettando delicatamente su e giù per tre volte. Centrifugare nuovamente le perle e scartare il soprannatante.

Ripetere questo passaggio due volte, per un totale di tre lavaggi finali, al fine di selezionare gli aptameri legati all'S 100 B. Recuperare i frammenti 32 plus e 30 plus che erano stati messi da parte in precedenza. Aggiungere i frammenti agli S 100 B legati alle perle. Quindi incubare il campione per 15 minuti.

Mescolare ogni tre minuti, pipettando delicatamente su e giù, dopo 15 minuti. Centrifugare brevemente le perle, eliminare il soprannatante, quindi lavare il complesso S 100 BDNA con 800 microlitri di buffer di selezione pipettando delicatamente. Quindi centrifugare le perle e rimuovere il soprannatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.

Per recuperare l'S 100, si selezionano gli abers aggiungendo 200 microlitri di tris 20 millimolare, HCL pH 7,4 alle perle. Successivamente, riscaldare la sospensione per tre minuti a 85 gradi Celsius. Dopo l'incubazione.

Vortexare le perle per un minuto e centrifugarle. Trasferire quindi il soprannatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio una volta e combinare i soprannatanti.

Infine, purificare i frammenti di DNA selezionati. Estrarre i prodotti della PCR due volte con un volume equivalente di cloroformio fenilico e alcol isopropilico. Precipitarli con cloruro di sodio 250 millimolare e 2,5 volte il volume di etanolo al 100% a meno 70 gradi Celsius per 15 minuti.

Centrifugare a 21.000 ×g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi eliminare il soprannatante. Lavare il pellet in modo efficiente con etanolo al 75%.

Centrifugare a 21.000 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e scartare il soprannatante. Asciugare il pellet in un vuoto rapido per tre minuti dopo 10 cicli di selezione. Clonare i frammenti di DNA amplificati mediante PCR risultanti nel vettore PCR 2.1 topo ottenuto da un core vitrogeno.

Quindi, eseguire il sequenziamento di 40-50 singole colonie per ciascuno dei frammenti N 30 cc e N 30 selezionati, utilizzando il primer M 13 forward. Allineare le sequenze selezionate mediante il software Infomax Vector NTI. Successivamente, determinare le sequenze consenso in base agli allineamenti.

Dopo aver identificato le sequenze consenso, acquistare gli aptameri consenso come descritto nel protocollo scritto. Sospendere il primo aptamero sintetizzato con un gruppo aminico C sei in posizione cinque prime in tampone di stampa fino a una concentrazione finale di 15 micromolare. Quindi depositare la soluzione di aptamero su vetrini attivati con code link utilizzando un array MicroGrid di Apogen Discoveries.

Seguire i protocolli raccomandati dal link del codice. Stampare ogni vetrino con 12 matrici. Utilizzare un formato due per otto.

Cassetta per ibridazione a microarray. Diluire la proteina S100B alla concentrazione appropriata in 70 microlitri di PBS. Applicare quindi la soluzione nei pozzetti della cassetta per microarray.

Sigillare la cassetta del microarray utilizzando un foglio adesivo privo di nucleasi per prevenire l'evaporazione. Lasciare che la proteina si leghi agli abers stampati sul codice link. Far scivolare per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione singolarmente.

Lavare i pozzetti della cassetta tre volte con PBS contenente cloruro di magnesio cinque millimolare o PBSM. Successivamente, diluire gli anticorpi secondari marcati con fluorocromo a 0,125 micromolare in 70 microlitri di PBSM. Riscaldare la miscela per tre minuti a 85 gradi Celsius.

Quindi lasciare raffreddare gli ABERS marcati sul ghiaccio. Applicare gli ABERS alle pozzette della cassetta per microarray per tre minuti. Sigillare nuovamente la cassetta con la pellicola adesiva e incubarla per un'ora a temperatura ambiente.

Di nuovo, singolarmente. Lavare i pozzetti tre volte con PBSM dopo il lavaggio. Smontare la cassetta e risciacquare l'intero vetrino con PBSM.

Quindi asciugare completamente il vetrino mediante centrifugazione. Infine, scansionare il vetrino utilizzando uno scanner Packard Biosciences ScanArray 4000 XL. Il legame è stato determinato per aptameri marcati all'estremità 5' con gamma P 32 A TP verso la proteina S 100 B e riportato in grafico in funzione della concentrazione per la determinazione della KD.

I kds rappresentativi dopo circa sette cicli di selezione sono tipicamente nell'ordine di 10 alla meno sette moli. Gli aptameri DERT con orientamento 5' furono accoppiati a microarray Code Link; la proteina S 100 B purificata fu legata al primo optimer e un secondo optimer marcato con LOR 5 46 fu legato al complesso formato dal primo optimer e dalla proteina S 100 B.

La fluorescenza è stata quantificata utilizzando uno scanner a scan array. La riga centrale mostra il legame a sandwich con ognuno caratterizzato da un legame additivo in saggi KD nelle righe sopra e sotto. Non vi è legame a sandwich per abers con derivatizzazione tiolica al cinque primi; gli abers sono stati accoppiati a nanofili d'oro utilizzando una chimica tiolica standard.

Gli aptameri secondari sono stati accoppiati a 50 NMO o a nanoparticelle d'oro nps nello stesso modo. La proteina purificata S 100 B è stata quindi legata inizialmente ai nanofili funzionalizzati; successivamente, gli aptameri secondari a concentrazione di 50 nanomolari e le nanoparticelle d'oro mps sono state legate ai complessi nanofilo-aptamero-S 100 B. I complessi a sandwich formati sono stati visualizzati mediante FE-SEM.

Un controllo negativo può essere osservato per un saggio di legame eseguito con la proteina HTRA1 al posto della proteina S100B. Bene, una delle cose più importanti riguardo alla procedura è che stiamo utilizzando un approccio privo di primer, in cui non abbiamo sequenze fisse che potrebbero causare falsi positivi e falsi negativi a causa delle sequenze stesse che dominano la regione casuale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale assicurarsi che il templato di DNA venga distrutto prima di ogni reazione di trascrizione inversa e prestare attenzione all'isolamento del prodotto specifico di RT-PCR dopo ogni ri-amplificazione.

Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.