Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il grado di codistribuzione dei batteri internalizzati, RIA Meningitidis, con la proteina del citoscheletro Alpha Actinin. Questo viene ottenuto infettando cellule microvascolari cerebrali umane in coltura con una coltura batterica di 24 ore per un periodo compreso tra tre e otto ore, consentendo ai batteri di entrare nelle cellule bersaglio. Come secondo passaggio, le cellule contenenti batteri intracellulari vengono lavate, fissate e quindi permeabilizzate, preparando così la coltura infetta per la colorazione immunoistochimica dei batteri internalizzati e dell'alpha actinin intracellulare.

Dopo l'acquisizione delle immagini confocali e l'applicazione di software per la codistribuzione, è possibile osservare le immagini della codistribuzione intracellulare e ottenere risultati quantitativi che mostrano come Meninga Croci che esprime OPC e anche una proteina di membrana possano interagire specificamente con l'alfa-actinina intracellulare, in base alla visualizzazione al microscopio confocale e all'analisi quantitativa della codistribuzione. Ciao, sono Isel Maria del laboratorio della Professoressa Mata TI presso il Dipartimento di Medicina Cellulare e Molecolare dell'Università di Bri. Oggi vi mostreremo un procedimento per la stima del livello di col, del rapporto tra batteri intracellulari e proteine del citoscheletro.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare un'interazione tra meningite miceliale che esprime una proteina di membrana auto OPC e la proteina del citoscheletro alfa-actina. Cominciamo dunque. Questo lavoro deve essere svolto in un laboratorio con adeguate misure di sicurezza.

Due giorni prima della procedura di immunomarcatura, inoculare il ceppo batterico di interesse su agar al brodo cerebello-cuore. Incubare le piastre di agar supplementate con il 10% di sangue equino inattivato termicamente durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica il giorno precedente l'immunomarcatura. Utilizzare un’ansa da 10 microlitri per preparare una sospensione della coltura batterica notturna.

In due millilitri di PBSB, lasciare in riposo la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente, in modo da permettere la sedimentazione dei grandi aggregati batterici. Successivamente, trasferire l'uno millilitro superiore della sospensione in un tubo sterile senza disturbare il pellet, solubilizzando i batteri aggiungendo un millilitro di SDS all'1% e idrossido di sodio 0,1 molare a due vial contenenti 20 microlitri di sospensione batterica e capovolgere il tubo per mescolare. Per stimare il numero di batteri.

Misurare il contenuto di acidi nucleici determinando l'assorbanza della soluzione. A 216 anteri, regolare la sospensione batterica alla densità richiesta nel mezzo di infezione per infettare le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano. Le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano o H-B-M-E-C-A, seminate due giorni prima della colorazione immunoistochimica, posizionare coprivetrini di vetro da 16 millimetri nelle pozzette di una piastra a 12 pozzette e seminare le HBMEC al 50% di confluenza sui coprivetrini, incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% il giorno successivo.

Infetta le cellule con la sospensione batterica appena preparata nel nostro laboratorio. Si utilizza comunemente un rapporto di infezione di 200-300 unità formanti colonie per cellula bersaglio. Incuba per tre fino a otto ore a 37 °C in presenza di 5% di anidride carbonica al termine del periodo di infezione.

Lavare le cellule tre volte con PBS e fissarle con 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la paraformaldeide, permeabilizzare le cellule fissate con paraformaldeide incubandole in Triton X-100 0,1% diluito in PBS per 10 minuti. Infine, lavare i campioni tre volte con PBS e procedere alla colorazione immunoistochimica come indicato. La successiva colorazione per i batteri intracellulari e per l'actinina può essere eseguita contemporaneamente.

In piastre a 12 pozzetti, bloccare le coprioggetti contenenti le cellule permeabilizzate con 500 microlitri di 3% B-S-A-P-B-S-T per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, trasferire ciascuna coprioggetto in un nuovo pozzetto asciutto della piastra a 12 pozzetti, aggiungendo contemporaneamente gli anticorpi primari contro i batteri e l'alfa-actinina; 80-100 microlitri di anticorpo per coprioggetto sono sufficienti se aggiunti con attenzione per coprire interamente la superficie della coprioggetto. Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 200 microlitri di PBS al pozzetto, sollevare la coprioggetto e posizionarla in un nuovo pozzetto contenente 500 microlitri di PBS. Dopo cinque minuti, rimuovere il PBS mediante pipetta e quindi aggiungere PBS fresco. Ripetere l'operazione due volte e trasferire le coprioggetti in un nuovo pozzetto asciutto.

Successivamente, aggiungere le opportune immunoglobuline secondarie coniugate con diversi fluorocromi, diluite in 1% B-S-A-P-B-S-T. Incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Alla fine dell'incubazione, eseguire il lavaggio come indicato in precedenza, quindi controcolorare il DNA con DPI per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine di questa incubazione, lavare le lamelle in PBS una volta, quindi montarle con una goccia di mezzo di montaggio. Le lamelle montate devono essere conservate al buio fino al momento dell'osservazione. Al microscopio, osserviamo e acquisiamo immagini dei nostri campioni immunoetichettati utilizzando un microscopio confocale a scansione laser collegato a un microscopio a fluorescenza episcopica invertito.

Per iniziare la procedura di CLSM, aggiungere una goccia di olio di immersione all'obiettivo e posizionare il vetrino con il coprioggetto, inserendolo delicatamente sul portapreparati del microscopio. Impostare il microscopio sulla modalità visiva e individuare l'area di interesse utilizzando gli oculari. A questo punto siamo pronti per utilizzare il software Leica. Selezionare la modalità di acquisizione XY zed. Scegliere il formato 5×12 per 5×12 per gli studi di codistribuzione.

Più alta è la risoluzione, più accurata sarà l'immagine. Quindi selezionare la modalità X bidirezionale, che aumenterà la velocità di scansione e contribuirà a ridurre il fotoblesamento. Impostare le opzioni di scansione sequenziale.

Fare clic sulla funzione SEC e quindi selezionare tra le linee. Selezionare i fasci laser in base ai fluorocromi coniugati agli anticorpi secondari. 4 0 5 nanometri per DPI, 4 88 nanometri per Alexa Fluor 4 88 e 5 61 nanometri.

Per trixy, attivare rispettivamente il tubo fotomoltiplicatore uno, due e tre. Impostare l'inizio e la fine dello stack o serie Z. Successivamente, impostare l'incremento Z a 0,2 micrometri.

RIA Mencius è un diplococco e, poiché ciascun coccus ha un diametro approssimativo di 0,5 micrometri, un incremento Z di 0,2 micrometri aumenta la probabilità di scansionare ciascun coccus almeno due volte. Impostare i parametri finali di scansione selezionando una media su tre linee per migliorare il rapporto segnale-rumore, cliccando su avvia. Le immagini colorate con doppia o tripla colorazione vengono ottenute mediante scansionamento sequenziale a diverse lunghezze d'onda e utilizzando la modalità tra le linee per ogni canale, al fine di eliminare il crosstalk tra i diversi cromofori.

Per un'indicazione della codistribuzione di due fluorocromi, selezionare la funzione di sovrapposizione per unire i canali selezionati in un'unica immagine. Ad esempio, quando entrambi i fluorocromi Alexa 4 88 e trissy Fluor sono codistribuiti, apparirà un colore giallo nell'immagine sovrapposta. Per una ricostruzione 2D necessaria per visualizzare la possibile codistribuzione, compilare lo stack Z o la serie utilizzando la funzione di proiezione massima. Dopo aver acquisito lo stack Z o la serie, elaborare i dati per ottenere un'immagine ortogonale per la visualizzazione della localizzazione intracellulare di vari elementi.

La quantificazione della codistribuzione è eseguita utilizzando il software Vol City della fornitura IMP. Per iniziare, creare una libreria con immagini CLSM, selezionando la messa a fuoco estesa dall'immagine nella barra superiore. Questo strumento combinerà gli stack Z in un'immagine 2D da analizzare.

Ora selezionare lo strumento COLOCALIZZAZIONE. I due canali da analizzare devono avere la stessa profondità di colore. Selezionare l'area che verrà quantificata.

Impostare la soglia per rimuovere qualsiasi sfondo. Creare l'output di colocalizzazione selezionando "genera colocalizzazione". Verranno generati i dati statistici di colocalizzazione per le regioni di interesse selezionate in precedenza.

Successivamente, selezionare i coefficienti di Mander R e ny. Infine, esportare i valori statistici in un documento Excel per la presentazione dei dati; qui mostrati sono risultati rappresentativi di immagini confocali di cellule endoteliali cerebrali umane infettate con meningococco per otto ore. La localizzazione dei batteri è indicata in rosso.

Sebbene la localizzazione dell'alfa-actinina sia mostrata con frecce verdi che indicano regioni in cui sembra essersi verificata un'elevata accumulazione di alfa-actinina attorno ai batteri. In questa immagine sovrapposta, vi sono diverse aree in cui appare un colore giallo-arancione, suggerendo una codistribuzione tra meningo-occi e alfa-actinina. In questa immagine successiva, la dissezione ottica di un monocstrato di H-B-M-E-C infetto indica una codistribuzione attorno ai batteri intracellulari localizzati alla base di una cellula.

Quando sono state elaborate immagini tridimensionali di monolayer di H-B-M-E-C infetti, una vista obliqua della superficie apicale mostra batteri Durant colorati di rosso, indicati dalla freccia rossa, dove diversi batteri si trovano in prossimità delle superfici basali delle cellule endoteliali, indicate dalla freccia gialla. Una localizzazione basale di colore arancione, giallo, può essere vista più chiaramente in questa sezione trasversale XZ endon. In contrasto con esperimenti di actinin da lontano, nei quali è stata effettuata l'etichettatura di batteri internalizzati e di menton o actina, si osserva una rara colocalizzazione con fermenting nelle cellule H-B-M-E-C, mentre la colocalizzazione con l'actina è occasionale.

Come osservato nei precedenti esperimenti, la Retin era concentrata attorno a diversi batteri internalizzati indicati dalle frecce bianche. I dati sono stati inoltre analizzati per ottenere il grado relativo di sovrapposizione. Il coefficiente R, che secondo Manda rappresenta il reale grado di codistribuzione IE, ovvero il numero di pixel che colocalizzano rispetto al numero totale di pixel, e i valori NY per l'alfa-actinina, la menting e l'actina nel complesso in H-B-M-E-C infettate da OPC esprimenti meningococchi, hanno mostrato una sovrapposizione superiore al 25% della rein nei meningococchi.

Il coefficiente e la Y sono una misura della frequenza di una valuta del segnale di rein più abbondante ogni volta che si verifica il segnale di meninga cocoa meno abbondante. Questa misura mostra un livello sorprendente di occorrenza di alfa-actinina nelle vicinanze di meninga cockeye internalizzata. Mostreremo semplicemente come visualizzare e quantificare l'introduzione di batteri internalizzati con elementi del citoscheletro all'interno di questo esperimento.

È importante ricordare di seguire scrupolosamente le procedure di fissazione e di immunomarcatura per mantenere l'integrità delle strutture ed evitare un elevato rumore di fondo. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.