Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Questo video illustra una procedura per effettuare l'imaging differenziale di due risonanze Raman associate a strutture biologiche mediante segnali di scattering Raman coerente. Inizialmente, tre laser a impulsi brevi e sincronizzati vengono sovrapposti nel tempo e nello spazio. I fasci sovrapposti vengono quindi inviati a un microscopio invertito standard, che permette la generazione di segnali Raman coerenti da oggetti microscopici.

I segnali vengono convertiti in immagini utilizzando un software commerciale al fine di confrontare i diversi segnali Raman prodotti. I risultati indicano che la differenza tra le immagini ottenute da segnali Raman doppiamente e semplicemente risonanti fornisce una sensibilità migliorata per segnali Raman deboli. Ciao, sono Tyler Weeks del Center for Bio Photonics presso l'Università della California di Davis.

Sono Thomas ER del Center for Bio Photonics e del Dipartimento di Medicina Interna dell'Università della California di Davis. Oggi vi mostreremo un procedimento per utilizzare la spettroscopia coerente anti-Stokes Raman a risonanza doppia al fine di produrre immagini chimicamente specifiche di cellule. Utilizziamo questo procedimento per rilevare segnali provenienti da molecole troppo deboli per essere rilevati direttamente mediante spettroscopia coerente anti-Stokes Raman da sola.

Iniziamo. Per generare simultaneamente segnali di risonanza Raman coerente (CARS) e CARS differenziale (DR-CARS), sono necessarie tre sorgenti laser a impulsi brevi, accordabili e sincronizzate. Per ottenere questi impulsi sincronizzati, si parte da un singolo laser a impulsi brevi con una potenza in uscita di 10 watt, una lunghezza d'onda fissa di 1064 nanometri, una durata dell'impulso fissa di sette picosecondi e una frequenza di ripetizione fissa di 76 megahertz.

Utilizzando una serie di lamine a mezza onda e cubi divisori del fascio polarizzanti, il fascio viene suddiviso in tre parti. Una lamina a mezza onda combinata con un cubo divisore del fascio polarizzante permette di regolare la quantità di potenza in ciascuna componente del fascio senza modificarne la direzione. Tipicamente, due fasci vengono regolati a circa 4,5 watt ciascuno, mentre il terzo fascio contiene l'uno watt rimanente.

I due fasci ad alta potenza vengono quindi indirizzati verso due oscillatori ottici parametrici indipendenti, o OPO. Gli OPO utilizzano la generazione di frequenze diverse per convertire un fotone ad alta energia in due fotoni a energia inferiore con lunghezze d'onda diverse. Controllando la temperatura del cristallo utilizzato per ottenere questo effetto, le lunghezze d'onda dei fotoni risultanti possono essere regolate con una precisione di 0,1 nanometri.

Raddoppiando la frequenza di questi segnali, un laser con una lunghezza d'onda fissa di 1064 nanometri può ora essere trasformato in un fascio laser accordabile in qualsiasi punto compreso tra 780 nanometri e 910 nanometri, pompando due OPO separati con la stessa sorgente a 1064 nanometri. Si ottengono così due sorgenti laser indipendentemente accordabili, sincronizzate automaticamente con il nostro laser pompa originale. Il terzo fascio proveniente dal laser pompa a 1064 nanometri viene deviato attorno agli OPO mediante una combinazione di specchi dielettrici, in modo che tutti e tre i fasci possano essere ricombinati successivamente.

Per produrre in modo efficiente fotoni di segnale Raman coerenti, gli impulsi ricombinati devono sovrapporsi sia temporalmente che spazialmente poiché gli OPO contengono cavità ad anello che permettono a ciascun impulso laser di attraversare il cristallo più volte; il fascio inviato attraverso gli OPO percorre una distanza aggiuntiva, causando un ritardo considerevole rispetto al fascio pompa originale. Questa distanza deve essere compensata mediante un terzo fascio, introducendo specchi aggiuntivi che costringono tale fascio a percorrere la stessa distanza degli altri due prima che avvenga la ricombinazione, utilizzando specchi dicromatici per consentire un aggiustamento fine della lunghezza del percorso. Ciascun fascio viene inviato attraverso stadi di ritardo regolabili, che permettono di regolare la sovrapposizione temporale degli impulsi laser diversi.

Un altro set di lamine semiriflettenti e cubi divisori del fascio polarizzante viene aggiunto a ciascun fascio per permettere la regolazione indipendente della potenza laser di ogni fascio. Specchi dicromatici vengono utilizzati innanzitutto per combinare i fasci provenienti dai due OPO, e successivamente il fascio a 1064 nanometri richiede particolare attenzione per garantire che i fasci siano sovrapposti con precisione nello spazio. Questo può essere verificato confrontando la sovrapposizione dei fasci a pochi centimetri dallo specchio dicromatico con quella a circa un metro di distanza dallo specchio dicromatico.

Essendo l'esposizione a fasci laser con elevata potenza media in grado di danneggiare il campione, i tre fasci combinati vengono inviati attraverso un modulatore elettro-ottico che funziona come un selettore di impulsi, il quale permette di regolare la frequenza di ripetizione degli impulsi che raggiungono il campione e, di conseguenza, la potenza media. I fasci laser combinati vengono quindi accoppiati a un microscopio invertito dotato di un obiettivo con elevata apertura numerica o NA. La focalizzazione stretta generata dall'obiettivo con elevata NA consente la generazione più efficiente di segnali Raman coerenti su scale di lunghezza microscopiche.

L'obiettivo del microscopio è montato su una piastra piezoelettrica X, Y, Z, che permette di ottenere immagini mediante una scansione raster dei fasci sul campione, simile a quella dei microscopi confocali commerciali a scansione di fascio. Vediamo ora come generare segnali CARS e D-R-F-W-M: l'interazione di tre fasci laser a impulsi brevi sul campione porta alla generazione di diversi segnali di mescolamento a quattro onde, come CARS derivanti dalle varie combinazioni di due laser, nonché segnali CARS a tre colori e segnali DR-CARS derivanti dalla combinazione di tutti e tre i laser. Quando i segnali sono relativamente vicini in lunghezza d'onda, può risultare difficile separarli per l'analisi.

Per questo motivo, i segnali vengono inviati a uno spettrometro di imaging che funge anche da monocromatore o filtro passa-banda, separando spazialmente i segnali a diverse lunghezze d'onda. Uno specchio ribaltabile azionato elettronicamente all'interno dello spettrometro, nella posizione abbassata, indirizza il segnale a una camera CCD (dispositivo a accoppiamento di carica) a illuminazione posteriore e deplezione profonda, che fornisce informazioni spettroscopiche sull'intero intervallo del segnale e ci permette di identificare e ottimizzare i vari segnali coerenti di robin per selezionare il segnale da immaginare. Ruotare semplicemente il reticolo all'interno dello spettrometro utilizzando il software di controllo e acquisizione dati fornito dal produttore per centrare il picco di interesse sulla camera CCD.

Quindi modificare la posizione dello specchio deviatore per indirizzare il segnale verso un secondo porto di uscita al quale è collegato un fotodiodo a valanga per il conteggio di singoli fotoni DDE o un PD. Eseguire una scansione raster dell'obiettivo e quindi utilizzare i segnali registrati sul fotodiodo a valanga per generare un'immagine visualizzando la frequenza di conteggio dei fotoni per ciascun pixel mediante il software di acquisizione dati. Ripetere questa procedura di imaging per ciascun segnale Raman coerente desiderato in modo che i segnali possano essere confrontati durante l'elaborazione successiva.

Ora vediamo come preparare correttamente un campione per ottenere immagini chiare e riproducibili. È necessario prestare particolare attenzione nella preparazione dei campioni. I campioni vengono tipicamente preparati su coprioggetti di vetro spessi circa 150 micron.

Questi vetrini sono abbastanza sottili da permettere un'immagine ad alta risoluzione mediante obiettivi ad immersione in acqua o in olio con alto valore di apertura numerica (NA), utilizzati in questi esperimenti. Per dimostrare la preparazione di un campione tipico, prepariamo sezioni di tessuto muscolare di topo di circa 20 micron di spessore, fissate su un vetrino da microscopio. Al campione viene aggiunta una goccia di 20 microlitri di soluzione acquosa di glucosio deuterato 5 M.

La soluzione di glucosio deuterato fornisce una firma unica e intensa nel background Raman. Un'ampolla di vetro viene posizionata sopra il campione e fissata con smalto per unghie per le cellule e la coltura. Possono essere utilizzate piastre di coltura con fondo in vetro che permettono l'acquisizione di immagini senza la necessità di staccare le cellule dalle piastre di crescita per colture cellulari.

Ora vediamo come determinare il rum e i picchi appropriati per le auto del Dr. Per sfruttare appieno l'effetto di amplificazione doppiamente risonante, è necessario conoscere gli spettri Raman di entrambe le sostanze risonanti Raman. Tipicamente, questi sono 2.845 cm⁻¹ associati ai lipidi e 2.121 cm⁻¹ per la modalità di stretching CD associata al glucosio deuterato.

La diffusione Raman coerente si ottiene quando la differenza di frequenza tra due laser corrisponde alla frequenza di una vibrazione molecolare. Regolando un OPO a 817 nanometri, esso sonda il modo C a 2.845 centimetri inversi quando combinato con il fascio laser a 1064 nanometri; regolando l'altro OPO a 868 nanometri, esso sonda il modo a 2.121 centimetri inversi quando combinato con il fascio a 1064 nanometri. In modalità spettroscopica, il microscopio CARS ci permette di osservare tre segnali Raman coerenti di interesse: un segnale CARS che sonda la vibrazione di allungamento CH, un segnale CARS che sonda il modo di allungamento CD e un segnale CARS-DR che sonda entrambi. Nel diagramma mostrato qui, frecce tratteggiate indicano i fotoni provenienti dai laser negli OPO, mentre frecce continue indicano il segnale risultante.

Le linee orizzontali continue indicano l'energia della vibrazione ramen e forniscono una rappresentazione visiva del fatto che, nei veicoli DR, la miscelazione simultanea degli stessi tre fotoni in ingresso sonda due diverse vibrazioni ramen. L'intensità del segnale per ciascun picco dovrà essere ottimizzata regolando con passi fini intorno a queste posizioni di picco. Qui selezioniamo ciascun picco ed acquisiamo immagini di vermi marini di sea elgan in una soluzione di glucosio derated, e l'estrazione di informazioni aggiuntive basata su queste tre immagini ottenute singolarmente richiede un'elaborazione delle immagini abbastanza semplice.

Prima di tutto, le immagini devono essere normalizzate. Un metodo pratico per la normalizzazione si basa sul fatto che i lipidi sono idrofobici. Ciò significa che in regioni con alta densità di lipidi, la risonanza CD del glucosio dovrebbe contribuire molto poco al segnale di risonanza doppia.

Al contrario, nelle regioni contenenti soltanto soluzione di glucosio, le risonanze CH provenienti dai lipidi dovrebbero contribuire in misura molto ridotta. Tenendo presente ciò, normalizzare l'immagine DR car e l'immagine car ottenuta sulla risonanza CD della soluzione di glucosio deuterato a una regione ben esterna al verme CL egan, che non dovrebbe mostrare alcuna risonanza CH. Successivamente, identificare una regione all'interno del verme nell'immagine car risonante CH ricca di lipidi e normalizzarla alla corrispondente regione all'interno dell'immagine DR car normalizzata.

Per far sì che questo metodo funzioni correttamente, si suppone che in profondità all'interno di questa regione non sia presente glucosio deuterato. Questa è un'ipotesi ragionevole poiché i lipidi sono idrofobi e non si mescoleranno con la soluzione. Ora, sottraendo l'immagine normalizzata del risonanza CH dal car dell'immagine normalizzata DR, rimane soltanto il segnale risonante CD amplificato, in modo analogo a come si ottiene sottraendo l'immagine normalizzata del risonanza CD car dall'immagine Dr.FWM normalizzata.

Resta visibile solo il segnale risonante CH amplificato. Qui è mostrato lo spettro Raman per un acido oleico modificato che include una modifica alchini, le forti risonanze CH a 2.845 cm⁻¹ e la risonanza alchina a 2.121 cm⁻¹ sono entrambe ben isolate dalla regione delle impronte digitali, ovvero la regione con picchi densamente compatti, rendendole marcatori ideali per l'imaging Raman coerente. Questo è uno spettro tipico di segnali Raman coerenti generati quando tre laser a impulsi brevi si sovrappongono all'interno del campione. Le frecce indicano i processi responsabili di ciascun segnale, rappresentati da diagrammi energetici.

Questi sono risultati tipici dell'acquisizione di immagini di vermi di C Elgin mediante DR cars e cars. La riga superiore ha utilizzato i tre segnali appena mostrati per acquisire un'immagine di un verme in una soluzione di glucosio deratato. Nella seconda riga, le immagini sono state opportunamente normalizzate e nella terza riga sono state prodotte le immagini di differenza sottraendo ciascuna immagine del car dall'immagine del DR car. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'acquisizione di immagini Raman di differenza basata sulla microscopia Raman coerente antis a risonanza doppia.

Quando si esegue questa procedura, ricordare che è importante assicurarsi che i fasci siano sovrapposti e sincronizzati correttamente. Inoltre, quando si passa da un segnale coerente all'altro, evitare di urtare o spostare il campione poiché ciò influirebbe sull'analisi. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.