Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

L'espressione di reporter fluorescenti in animali transgenici permette di seguire le risposte cellulari a manipolazioni sperimentali in modelli viventi di malattia. Qui, la perdita selettiva di cellule viene indotta farmacologicamente nel pesce zebra; vengono acquisite immagini multicolore ad alta risoluzione mediante microscopia confocale delle cellule bersaglio e dei loro immediati vicini prima, immediatamente dopo e a intervalli successivi al trattamento con il farmaco. L'analisi delle immagini dimostra l'attivazione di popolazioni endogene di cellule staminali e la successiva sostituzione delle cellule bersaglio durante la fase di recupero.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia rigenerativa, come ad esempio: Quali sono i meccanismi cellulari e molecolari utilizzati per rigenerare tipi cellulari specifici? Iniziare trasferendo le uova transgeniche raccolte da incroci in una capsula di Petri contenente soluzione 0,3 x danio a 16 ore post-fecondazione. Aggiungere PTU per inibire l'attività della tirosina ACE prima di qualsiasi evidenza di pigmentazione nel tessuto di interesse. Se l'embrione non è albino, incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius.

Una volta evidenti i reporter, posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico a zoom fluorescente e selezionare l'espressione del transgene desiderata. Prima dell'acquisizione delle immagini, preparare una soluzione di montaggio al 0,5% di agarosio a basso punto di fusione in mezzo per embrioni e conservarla a 40 gradi Celsius.

Aggiungere trica e PTU se necessario. Mescolare delicatamente e riportare a 40 gradi Celsius. Anestetizzare i pesci ponendoli in un mezzo embrionale contenente trica.

Per circa tre minuti, i pesci diventeranno non reattivi. Per toccarli utilizzando una micropipetta, aspirare singoli pesci in una punta di pipetta tagliata con un volume di circa 30 microlitri di soluzione anestetica. Successivamente, capovolgere la pipetta e lasciare che i pesci si depositino sul fondo.

Toccare la punta con la soluzione di montaggio e lasciare che il trasferimento avvenga per gravità. Prestare attenzione a non diluire l'agro in modo che possa essere riutilizzato. Smaltire la soluzione anestetica rimanente dalla micropipetta.

Quindi, utilizzando la stessa punta, trasferire il pesce in una piastra di Petri. In circa 30 microlitri di soluzione di montaggio, orientare delicatamente il pesce in modo che la regione di interesse sia centrata nella goccia di aeros. Assicurarsi che il pesce mantenga l'orientamento desiderato fino a quando l'aeros non si solidifica.

È possibile montare più pesci in una singola piastra di Petri, se desiderato. Dopo che l'agarosio si è solidificato, trasportare i pesci sul palchetto del microscopio confocale e aggiungere delicatamente nel piatto del mezzo per embrioni contenente trica più o meno PTU, fino a quando i pesci non sono completamente immersi. Aprire il software di acquisizione immagini e mettere a fuoco la regione di interesse per un'ottimale visualizzazione dei dettagli cellulari e/o molecolari.

Utilizzare obiettivi con lunga distanza di lavoro e alte aperture numeriche nel software. Selezionare le corrette quattro florali dall'elenco del selettore. Fare clic su impostazione spettrale ed effettuare regolazioni sugli intervalli di emissione.

Per ottenere una separazione pulita dei segnali del reporter e massimizzare i rapporti segnale-rumore, selezionare l'obiettivo appropriato nel menu a discesa per assicurare che tutti i preset definiti dal software siano regolati correttamente. Per mettere a fuoco i laser e impostare i livelli di potenza, selezionare un output dalla tabella di ricerca che indichi la saturazione dei pixel per ogni canale.

Successivamente, impostare la sensibilità del rilevatore per ottenere la qualità dell'immagine desiderata, aumentando gradualmente l'uscita del laser finché l'intensità dell'immagine non risulti accettabile. Evitare la saturazione dei pixel nella regione di interesse e mantenere i livelli del laser il più bassi possibile, al fine di ridurre i problemi di fotobiancamento e fototossicità.

Assicurarsi che ogni linea laser produca un segnale rilevabile solo nel canale appropriato attivando e disattivando manualmente i laser mentre si monitorano tutti i canali di acquisizione. Se non è evidente alcun crosstalk, tutti i canali possono essere acquisiti contemporaneamente. Successivamente, inquadrare l'area di interesse utilizzando le funzioni di zoom e rotazione.

Impostare quindi la velocità di scansione e le dimensioni dell'immagine utilizzando velocità di scansione più elevate, che riducono il tempo di permanenza del laser e aumentano la risoluzione temporale. Impostare la dimensione del passo nella dimensione Z in base alle esigenze sperimentali. In questo caso, una dimensione del passo di 10 micrometri viene utilizzata per acquisire sette sezioni ottiche di tessuto retinico.

Dopo aver determinato le impostazioni appropriate, acquisire le immagini di Zack e salvarle. Successivamente, passare al pesce successivo. L'acquisizione seriale con rilascio immediato può essere eseguita per monitorare le variazioni cellulari nei giorni successivi, seguendo le istruzioni riportate nel documento scritto allegato.

Quando si esegue un esperimento di imaging multiplo con reporter, è preferibile utilizzare fluorofori i cui spettri siano ben separati. Tuttavia, ciò non è sempre pratico. Qui mostriamo un semplice metodo di sottrazione delle immagini, mediante il software open source ImageJ, per separare fluorofori con profili di eccitazione ed emissione sovrapposti. Nel nostro caso, GFP e YFP.

Le tecniche di imaging temporale descritte in questo video sono state utilizzate per monitorare cellule staminali retiniche marcate con GFP durante l'ablazione e la rigenerazione di neuroni bipolari retinici. Per eseguire la separazione spettrale, acquisire immagini utilizzando modalità di imaging sequenziale e impostazioni variabili del filtro passa-banda, che consentono rispettivamente di acquisire in modo indipendente e di separare parzialmente fluorescenze sovrapposte. Una volta acquisite le immagini, utilizzare l'importazione ImageJ loci bio formas per aprire i file immagine e avviare lo strumento di importazione. Trascinare il file di interesse nella finestra di ImageJ.

Dividere i canali in singoli stack utilizzando la casella di controllo "dividi canali" nella finestra di importazione per avviare il plugin allinea tre TP. Fare clic su plugin, quindi su allinea stack. Quindi su allinea tre tp.

Le serie devono essere allineate per garantire una corretta sottrazione. Selezionare la serie di riferimento nella prima casella a discesa e la serie non allineata nella seconda. Selezionare le opzioni usa origine relativa XY e usa origine relativa Z, quindi fare clic su ok.

Per avviare il processo di allineamento, fare clic sul pulsante di registrazione del volume. Apparirà una nuova finestra contenente i parametri di allineamento. Fare clic su ok.

Questa sezione è stata ottimizzata dal distributore del plugin e non richiede modifiche. Al termine, verrà visualizzata una finestra con gli stack allineati. Selezionare l'output dalla finestra allineata per aprire la finestra di output.

Questa finestra è anche ottimizzata e non richiede modifiche. Fare clic su OK. Un nuovo stack apparirà nell'area di lavoro con "allineato" aggiunto alla fine del titolo del file.

Per rimuovere il crosstalk utilizzando il calcolatore di immagini, fare clic su elabora, quindi su calcolatore di immagini. Selezionare nella casella a discesa immagine uno la serie da sottrarre e nella casella a discesa immagine due la serie da utilizzare nella sottrazione. Nella casella a discesa operazione, selezionare sottrai e fare clic su ok.

Image J chiederà di elaborare lo stack. Selezionare sì. Dovrebbe apparire un nuovo stack, che ha eliminato il crosstalk tra i canali sovrapposti.

Unire gli stack per ricreare la stessa struttura dell'immagine prima dell'allineamento e della sottrazione. Selezionando i canali uniti nella finestra degli strumenti per i canali, lo strumento consente di fondere fino a quattro stack in un hyper stack. Infine, colorare i canali, regolare luminosità e contrasto e salvare i file in formato tiff per esaminare la perdita mirata e la rigenerazione della nitro riduttasi.

Cellule bipolari retiniche che esprimono M cherry. È stata acquisita una serie temporale di immagini confocali in singoli zebrafish prima del trattamento. È presente un'espressione a mosaico del reporter YFP marcato sulla membrana nelle cellule bipolari di controllo, mostrato in giallo, e della proteina fusione cherry nitro riduttasi nelle cellule bipolari bersaglio, mostrata in rosso.

Il transgene CFP marcato sulla membrana mostrato in ciano fornisce informazioni contestuali sulla maggior parte delle altre cellule retiniche per una maggiore chiarezza. La stessa immagine senza il segnale CFP è mostrata dopo il trattamento con metronidazolo. Le cellule bipolari esprimenti la nitro riduttasi rosse vengono perse, mentre le cellule bipolari controllate gialle sono risparmiate.

Questo dimostra la natura altamente specifica di questa metodologia di ablazione. Ancora una volta, la stessa immagine senza CFP è mostrata per chiarezza. Quando metro NIAZ viene rimosso, le cellule che esprimono NTR ritornano qui.

Un esempio del metodo di sottrazione G-F-P-Y-F-P è mostrato in questa figura: GFP etichetta Mueller. Le cellule GL sono mostrate in verde e le cellule bipolari etichettate con YFP sono mostrate in viola. L'overlap tra le due produce il bianco per eseguire la sottrazione.

Le immagini GFP e YFP devono essere prima allineate. Il processo di sottrazione consente quindi di rimuovere dall'immagine GFP le cellule bipolari marcate con YFP, permettendo così di rappresentare chiaramente le cellule di Müller marcate con GFP e di rilevare le cellule di Müller più deboli. L'overlap tra le cellule di Müller deboli, ggl e le cellule bipolari marcate con M cherry mostrate in rosso può ora essere verificato.

I dati mostrati qui suggeriscono che l'ablazione delle cellule bipolari induce i ggl Muller a sostituire le cellule perse. Questa interpretazione è in linea con studi recenti sulla rigenerazione retinica, che implicano i ggl di Müller come progenitori indotti dal danno sia nei mammiferi che nei pesci. Questa tecnica permette ai ricercatori di esplorare i meccanismi che regolano la rigenerazione di specifici tipi cellulari attraverso la visualizzazione delle cellule staminali nel pesce zebra.