Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Il trapianto di isolotti pancreatici è stato proposto come un possibile trattamento per il diabete di tipo 1. Tuttavia, due limitazioni principali ne impediscono l'adozione diffusa nella pratica clinica. In primo luogo, è necessario un numero elevato di isolotti per ogni ricevente.

Poiché le isole pancreatiche vengono ottenute da donatori d'organo, il numero di potenziali riceventi è fortemente limitato. Il trapianto di seconda intenzione richiede un trattamento a vita con potenti immunosoppressori, esponendo il paziente, in particolare la popolazione pediatrica, al rischio di neoplasie, infezioni e insufficienza renale. Il trapianto di isole pancreatiche sotto la capsula renale del topo viene effettuato per studiare strategie volte a migliorare gli esiti clinici del trapianto.

Occhietti isolati da topi donatori sani, suddivisi in gruppi e preparati per il trapianto. Gli occhietti vengono quindi trapiantati nello spazio sottocapsulare del rene. In topi riceventi diabetici, la funzionalità dell'innesto di occhietti viene valutata monitorando i livelli di glucosio nel sangue, i quali mostrano che circa 250-350 occhietti ripristinano la glicemia normale in un topo ricevente di 20 grammi entro 24 ore dal trapianto.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per i passaggi relativi alla cannulazione. Il dotto biliare comune e il trasferimento degli occhielli nello spazio sottocapsulare del rene sono difficili da apprendere. Questi passaggi richiedono l'identificazione delle strutture tissutali, mano ferma e l'uso di una tecnica che minimizzi i danni ai tessuti.

Posizionare un topo eutanasizzato in posizione supina su un tovagliolo di carta sotto la lente di dissezione e spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Utilizzare le forbici per aprire l'addome con un'incisione a V dalla regione pubica fino alle zampe anteriori. Il topo si trova al di sotto della lente di dissezione.

Posizionarlo con la testa rivolta verso l'osservatore. Individuare l'ingresso duodenale del dotto biliare comune mediante una pinza emostatica, ovvero l'apertura duodenale del dotto biliare comune. La pinza emostatica deve essere posizionata in modo tale che, quando compressa, si allinei esattamente lungo il margine tra pancreas e intestino.

Qui verranno dimostrati due metodi per cannuilare il dotto biliare. Il metodo con mano libera e il metodo con assistenza di pinze per cannuilare il dotto biliare. Utilizzando il metodo con mano libera, tirare con l'emostatico fissato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventi teso.

Esiste una confluenza nel dotto biliare in prossimità del fegato, dove la bile proveniente dalla cistifellea e gli enzimi provenienti dal fegato si uniscono. Prima che la bile entri nell'intestino, tendere il dotto biliare per esporre l'interno della conformazione a V. Utilizzare un ago da 27 gauge piegato, collegato a una siringa da cinque millilitri, in modo che l'ago penetri esattamente attraverso la V e cannuli direttamente la porzione inferiore del dotto. Far scorrere l'ago di alcuni millimetri oltre la fine della bisellatura per prevenire il reflusso verso il fegato e la cistifellea.

Una volta completata con successo la cannulazione, perfondere il pancreas erogando due millilitri di liasi dalla siringa. Osservare l'espansione del pancreas sopra lo stomaco come indicazione di una cannulazione ottimale. In alternativa, è possibile cannulare il dotto biliare.

Utilizzando il metodo della cisti con pinzetta. Tirare l'emostatico C fissato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda, in modo che il coledoco si tenda. Quindi, utilizzando un ago curvato da 27 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri, perforare la fascia al di sotto del coledoco vicino al fegato.

Usare l'ago per rimuovere la fascia dal dotto con l'ago ancora in posizione. Appoggiare l'emostatico e prendere un paio di pinze. Utilizzare un braccio delle pinze aperte per sostenere il dotto biliare nel punto in cui l'ago ha rimosso la fascia, tirando contemporaneamente il dotto e le pinze in avanti.

Fare scivolare l'ago nel dotto utilizzando la pinzetta come appoggio posteriore. Una cannulazione riuscita è indicata da un espansione uniforme della regione del pancreas situata sopra lo stomaco. Una volta che il pancreas è stato perfuso, rimuovere l'emostatico dal duodeno.

Quindi utilizzare la pinzetta per sollevare il duodeno e usare una seconda pinzetta per separare il pancreas dall'intestino. Successivamente, staccare il pancreas dalla parte superiore dello stomaco e dalla milza. Infine, sollevare il pancreas dall'addome e reciderlo dai rimanenti collegamenti fasciali con l'intestino, lo stomaco e la milza.

Posizionare il pancreas in un tubo conico da 50 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Incubare il pancreas a 37 gradi Celsius seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato. Dopo l'incubazione, aggiungere 20 millilitri di mezzo ai tubi e dissociare il tessuto agitando vigorosamente i tubi 40 volte in 10 secondi.

Questo passaggio è fondamentale per un recupero ottimale delle viole. Centrifugare le cellule a 800 giri al minuto. Risospendere in 15 millilitri di mezzo e concentrare i campioni.

Versare la sospensione attraverso un setaccio in filo metallico da 0,419 millimetri e convogliarla in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare il primo tubo con ulteriori 10 millilitri di mezzo contenente il 10% di siero fetale bovino e versare il liquido attraverso il setaccio in filo metallico. Pellettizzare le cellule mediante centrifugazione, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di His opaque 10 77 a temperatura ambiente. Vortexare delicatamente per alcuni secondi, aggiungere ulteriori cinque millilitri di His opaque lungo la parete interna del tubo per lavare le cellule dalle pareti del tubo. Pipettare lentamente per sovrapporre 10 millilitri di RPMI privo di siero lungo la parete del tubo a una velocità di un millilitro ogni 10 secondi.

Deve essere evidente un'interfaccia netta. Successivamente, centrifugare i campioni in una centrifuga con rotor a cestello oscillante a 20 gradi Celsius e 900 volte la forza di gravità per 20 minuti, con accelerazione molto lenta e senza frenata al termine della centrifugazione; le isole verranno separate dalle cellule esocrine utilizzando una pipetta sierologica monouso da 10 millilitri. Trasferire le isole dall'interfaccia del mezzo histo Paque a un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

È possibile raggruppare diversi tubi a questo punto per rimuovere i residui di anellini, riempire i tubi opachi con mezzo contenente siero e pelletizzare le isole centrifugando i tubi per due minuti a 800 giri al minuto. Successivamente, risospendere le isole in mezzo fresco. Ripetere questo passaggio almeno due volte.

Sospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo. Posizionare un filtro in nylon da 0,1 millimetri al contrario su un tubo conico da 15 millilitri. Pipettare la sospensione cellulare attraverso il filtro per raccogliere gli anellini.

Quindi risciacquare il tubo da 50 millilitri con ulteriori sei millilitri di mezzo e farli passare attraverso il filtro. Posizionare una goccia di mezzo da tre millilitri in una piastra di Petri da 10 centimetri. Capovolgere il filtro cellulare e immergerlo nella goccia di mezzo per raccogliere gli inserti; pipettare ulteriori cinque-sette millilitri di mezzo di coltura attraverso il filtro nella piastra di Petri.

Per raccogliere eventuali anelli rimanenti dal setaccio sotto un obiettivo 4x, prelevare gli anelli singolarmente con una pipetta P200 e trasferirli in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Queste immagini mostrano anelli isolati da topi C57BL/6 di 12 settimane. La purezza e la qualità degli anelli possono essere stimate al microscopio al termine della procedura di isolamento.

Ad esempio, le due immagini mostrate qui riportano un campo rappresentativo in cui sono presenti detriti e contaminazione da cellule esocrine. Quando si selezionano gli isolotti per un esperimento, evitare di raccogliere cellule esocrine contaminanti o isolotti che appaiono non sani. Gli isolotti con centri necrotici sono non sani, come mostrato in questa figura scattata 24 ore dopo l'isolamento; i centri necrotici non saranno visibili immediatamente dopo l'isolamento.

Le occhielli costituiti da cellule in desquamazione sono inevitabili e possono essere utilizzati nel trapianto di occhielli, come mostrato in questo video con lapse temporale di 24 ore. Immediatamente dopo l'isolamento, si sviluppano centri necrotici all'interno di molti occhielli. Verso la fine della registrazione, durante la selezione degli occhielli, questi centri necrotici sembrano essere espulsi dall'occhiello.

Raggrupparli in modo che ogni tubo presenti una distribuzione uniforme di qualità e dimensioni degli occhielli. Ad esempio, ogni gruppo di 15 occhielli potrebbe contenere quattro occhielli di dimensioni grandi, sei occhielli medi e cinque piccoli. Posizionare il tubo sul ghiaccio; gli occhielli possono essere utilizzati immediatamente per il trapianto o manipolati.

Prima dell'uso, inserire una punta sterile per caricamento gel nell'apertura di una provetta microfusa da 1,5 millilitri in modo da formare una curva leggera, che crei una forma a U nell'estremità stretta della punta. Entrambe le aperture della punta devono essere rivolte direttamente verso l'alto, fuori dalla provetta microfusa.

Rimuovere delicatamente un tubo di occhielli dal ghiaccio. Assicurarsi che tutti gli occhielli si siano depositati sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta P200, raccogliere delicatamente gli occhielli in un volume minimo dal fondo del tubo e trasferirli sulla punta curva preparata.

Dopo che gli occhielli si sono sedimentati, rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo aspirandolo attraverso l'apertura larga dell'estremità per caricamento gel contenente gli occhielli, utilizzando una nuova estremità per caricamento gel collegata a una pipetta P200. Collegare l'estremità non smussata del tubo all'apertura stretta dell'estremità per caricamento gel contenente gli isolotti. Quindi fissare l'estremità alla pipetta P200 e spingere delicatamente gli isolotti all'interno del tubo.

Successivamente, collegare il bordo non smussato del tubo PE 50 all'ago di una siringa Hamilton da 25 microlitri. Con lo stantuffo ritratto, premere lo stantuffo della siringa finché gli occhielli si trovino a circa 0,5 centimetri dall'apertura smussata. Mettere da parte la siringa in modo che gli occhielli possano accumularsi in un unico ammasso vicino all'apertura smussata del tubo, mentre il rene viene preparato per ricevere gli occhielli.

Preparare il sito chirurgico tagliando i peli e strofinando la pelle con Betadine alternato ad alcol isopropilico al 70% per tre volte. Iniziare la procedura di trapianto dell'occhiello eseguendo una pinzatura del dito del piede per confermare l'anestesia nel topo ricevente. Posizionare l'asta di una bacchetta di vetro direttamente sotto il topo e al di sotto del rene, perpendicolarmente al midollo spinale.

Quindi individuare il rene attraverso la cute e posizionare un campo chirurgico sterile. Una volta localizzato il rene, utilizzare forbici McFerson banis per praticare un'incisione di due centimetri attraverso il derma direttamente al di sopra di esso, perpendicolarmente al midollo spinale. Questa incisione esporrà la parete peritoneale con le forbici.

Eseguire un'incisione di un centimetro attraverso la parete peritoneale nella stessa direzione del taglio attraverso lo strato dermico, utilizzando l'asta della bacchetta di vetro come appoggio; far fuoriuscire il rene attraverso l'apertura peritoneale premendo sulla superficie adiacente. Inumidire la superficie del rene esposto con PBS sterile e freddo su ghiaccio utilizzando un applicatore di cotone imbevuto. Ripetere l'operazione ogni pochi minuti secondo necessità per evitare che la capsula renale si secchi.

Utilizzando un ago da 27 gauge, praticare un'incisione di 0,2 centimetri attraverso la capsula renale lungo la superficie anteriore del rene. Partendo dal lato laterale sinistro verso il lato laterale destro, inserire un capillare di vetro tirato a fiamma. Introdurre il capillare nell'incisione precedentemente effettuata e spostarlo in direzione posteriore lungo la superficie laterale dorsale del rene.

Per creare una tasca tra la capsula renale e il parenchima renale, posizionare le asole della siringa Hamilton da 25 millilitri preparata fino all'estremità dell'apertura smussata del tubo flessibile. Inserire quindi il bordo smussato con la parte inclinata rivolta verso l'alto nella tasca sottocapsulare. Il bordo più lungo è a contatto con il parenchima renale.

Spostare la provetta all'estremità più posteriore della capsula. Quindi trasferire lentamente gli anellini dalla provetta PE 50 nella tasca sottocapsulare premendo lo stantuffo della siringa. Mentre gli anellini riempiono la tasca, ritirare lentamente la provetta flessibile per creare più spazio.

Dopo aver rimosso il tubo dalla borsa, far scorrere la sonda di vetro lungo la superficie esterna del rene, dalla parte anteriore a quella posteriore, per inserire delicatamente gli occhielli nell'estremità prossimale della borsa. Utilizzando pinze con braccio piegato, sollevare il rivestimento peritoneale adiacente all'apertura praticata per il rene. Quindi usare un applicatore di cotone imbevuto di PBS per spingere delicatamente il rene all'interno della cavità peritoneale.

Chiudere la cavità dell'animale applicando punti di sutura alla parete peritoneale e clip da ferita allo strato dermico. Restituire il topo alla sua gabbia e monitorarlo. Per il recupero, fornire acqua con acetomine per l'intestino del topo.

Occhioli di mouse C isolati. Utilizzando i metodi descritti in questo video, è stata trapiantata una dose curativa in topi allogenici C57 Black Six. I livelli di glucosio nel sangue non a digiuno sono stati monitorati a partire dal primo giorno postoperatorio.

Il rigetto si osserva intorno al giorno 17 in topi riceventi di 20 grammi che hanno ricevuto 300 occhielli da un donatore allogenico. Qui è stato monitorato il recupero in topi che hanno ricevuto 150 o 300 occhielli da donatori sinnigenici. Nessun rigetto è osservato in questi trapianti poiché gli occhielli provengono da donatori sinnigenici.

La dose di campanule somministrata misura la funzione primaria delle campanule immediatamente dopo il trapianto. Mentre si è osservato un recupero marginale con 150 campanule, si è assistito a un recupero completo quando sono state trapiantate 300 campanule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire i passaggi fondamentali necessari per isolare le campanule del topo e trapiantarle nello spazio sottocapsulare del rene.

Con la pratica, svilupperete la capacità di cannuccolare rapidamente il dotto biliare comune, che è il passaggio più difficile di questo protocollo.