Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 ^Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Il trasporto assonale può essere studiato visualizzando i nervi segmentali delle larve. Un Drosophila di terzo stadio. La larva viene prima dissezionata, esponendo il sistema nervoso centrale senza danneggiare i lobi ottici, il ganglio ventrale e i nervi segmentali.

Il secondo passaggio della procedura consiste nel fissare la larva in formaldeide prima di incubarla con l'anticorpo primario durante la notte e con l'anticorpo secondario per un'ora al buio. Successivamente, la larva viene montata su un vetrino e si analizzano i difetti del trasporto assonale. La localizzazione e la distribuzione delle proteine possono essere esaminate mediante microscopia a immunofluorescenza.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul trasporto assonico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la morfologia delle sinapsi e dei muscoli. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché inizialmente è difficile eseguire questa dissezione consentita, specialmente nel mantenere intatti i nervi segmentali del cervello e i muscoli. Per iniziare questa procedura, preparare un tampone di fissaggio per dissezione 1x, PBT 1x e una soluzione di BSA al 5%.

Come specificato nella tabella mostrata prima della dissezione, procurarsi un paio di pinze pulite numero cinque per il bicipite, un paio di forbici pulite a lama dritta a ventaglio e dei perni per iniziare la dissezione; utilizzare un cucchiaino microscopico per raccogliere le larve vaganti di terzo stadio con un genotipo specifico e trasferirle in una piastra di Petri. Successivamente, lavare le larve risciacquandole in una piastra di Petri riempita con acqua deionizzata per rimuovere completamente il cibo.

Successivamente, posizionare un avannotto sulla piastra S con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Fissare l'avannotto alle estremità anteriore e posteriore. Aggiungere una goccia del buffer di dissezione monouso sull'avannotto fissato utilizzando forbici fini.

Pinzare la larva lungo la linea mediana dorsale in prossimità dell'estremità posteriore. Utilizzando le forbici, tagliare la cuticola della larva dall'estremità posteriore fino a quella anteriore. Applicare una goccia di buffer di dissezione appena preparato sulla larva dissezionata.

Utilizzando un ago, prendere un margine laterale della cuticola vicino al centro della larva e fissare la cuticola con un altro ago. Fissare il secondo margine laterale della cuticola, utilizzando due aghi per ciascun lato laterale come mostrato nel diagramma. Ora, rimuovere con cura l'intestino e i corpi adiposi e traia, lasciando soltanto il cervello con i due lobi ottici e i gangli ventrali.

Con i nervi segmentali attaccati, si procede alla fissazione e alla colorazione con anticorpi lasciando le larve attaccate alla guardia della piastra. Incubare le larve dissezionate in 50 microlitri di fissativo per 30 minuti. Dopo la fissazione, sostituire il fissativo ogni 15 minuti e risciacquare le larve in PBT 1x per 30 minuti.

Sostituendo il buffer ogni 10 minuti, è importante notare che le larve devono essere sempre immerse nel buffer. Preparare la soluzione dell'anticorpo primario diluendolo alla concentrazione appropriata nella soluzione di BSA al 5%. Le concentrazioni ottimali variano a seconda degli anticorpi.

Costruire una camera umida rivestendo una piastra di plastica con un fazzoletto di carta Kim. Inumidito con acqua. Sostituire l'ultimo con PBT.

Risciacquare con la soluzione di anticorpo primario preparata e incubare in camera umidificata a quattro gradi Celsius durante la notte il giorno successivo. Risciacquare le larve dissezionate in PBT 1x per 30 minuti, sostituendo il tampone ogni 10 minuti. Preparare l'anticorpo secondario diluendolo alla concentrazione appropriata nella soluzione di BSA al 5%.

Avvolgere la camera umida con della pellicola di alluminio, poiché alcuni anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Incubare le larve con la soluzione di anticorpo secondario a 25 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione con l'anticorpo secondario, risciacquare le larve in PBT 1x per 30 minuti, sostituendo il buffer ogni 10 minuti, quindi procedere al montaggio e alla visualizzazione delle larve dissezionate prima di montare la larva sul vetrino.

Preparare il vetrino stendendo due linee verticali di colla per unghie al centro, con uno spazio sufficiente affinché un coprioggetto possa appoggiarvisi come mostrato nel diagramma. Lasciare asciugare completamente la colla per unghie. Una volta che la colla è asciutta, posizionare una goccia di buffer di montaggio nello spazio tra le linee verticali di colla per unghie sul vetrino, come mostrato in questa immagine.

Il vetrino è ora pronto per essere montato. Recuperare le larve dopo l'ultimo lavaggio con PBT. Risciacquare e rimuovere delicatamente i perni laterali da una larva.

Attenzione a non strappare con cura la cuticola. Rimuovere i due spilli rimanenti e prendere la larva con la pinzetta, quindi posizionarla sul vetrino preparato. Assicurarsi che la larva non sia capovolta e sia orientata in posizione ventrale.

Posizionare delicatamente un coprioggetto sopra il campione con il lato superiore rivolto verso l'alto e sigillare i bordi con lo smalto per unghie come illustrato qui. I larve sono ora pronte per essere visualizzate al microscopio a fluorescenza. Questa immagine rappresentativa mostra una larva di tipo selvatico colorata con anticorpi diretti contro la proteina delle vescicole sinaptiche, la cysteine string protein.

I nervi segmentali di lava sono colorati uniformemente. Qui, un mutante della proteina motrice lava è stato colorato con anticorpi contro CSP. I nervi segmentali mostrano accumuli massicci che risultano intensamente positivi per CSP.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere i nervi segmentali attaccati al cervello e di conservare i muscoli integri. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare la dissezione. Fissare un terzo campione per immunomarcatura e iniziare a isolare i nervi segmentali larvali per studiare il trasporto assonale mediante microscopio fluorescente.