Cella Transfection singola in embrioni di pollo

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare singole cellule di somiti di pollo o di tubi neurali con un plasmide che codifica per la proteina verde fluorescente. Questo viene realizzato innanzitutto tirando pipette per microiniezione con un diametro adeguato dell'apertura della punta. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare una soluzione madre di plasmide per le iniezioni.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel preparare gli embrioni per l'iniezione. Il quarto passaggio della procedura consiste nel caricare le micropipette con DNA plasmidico. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'iniettare nei tessuti desiderati.

Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la variabilità del numero di cellule prodotte da singoli progenitori marcati in specifici sottomodi del somite e del tubo neurale, mediante microscopia a immunofluorescenza. Ciao, sono Rael del laboratorio del Professor Heim del Dipartimento di Neurobiologia Medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Oggi vi mostreremo una procedura per l'iniezione di singole cellule nei somiti e nei tubi neurali di pollo.

Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare la segregazione delle linee di cellule somitiche e del tubo neurale. Cominciamo dunque a generare singole cellule trasfettate in embrioni di pollo iniziando con il tirare le micropipette. Tiriamo le nostre pipette con un tiratore di pipette standard Naga PP 83 utilizzando un'impostazione di calore pari a 13,5.

La regolazione precisa deve essere calibrata per ottenere un diametro della punta della pipetta compreso tra otto e dieci micron. Utilizziamo filamenti contenenti tubi di vetro borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno compreso tra 0,75 e 0,78 millimetri. È inoltre possibile utilizzare micropipette disponibili in commercio, prive di filamento, con diametro esterno di un millimetro e diametro interno di 0,75 millimetri.

Le pipette preparate vengono conservate in una capsula di plastica con le punte protette dal contatto con il bordo della capsula. Per preparare il DNA da microiniettare, il plasmide di interesse viene trasfettato in DH five alpha e coli. Il giorno successivo, utilizzando procedure standard, il plasmide viene purificato mediante un kit Maxi prep; per iniezioni non clonali, utilizziamo una concentrazione di DNA di un microgrammo per microlitro.

Per esperimenti in cui si desiderano cloni individuali, la concentrazione del plasmide sarà molto più bassa e dovrà essere regolata. Per il P-C-A-G-G-F-P-A, una concentrazione compresa tra 0,05 e 0,1 microgrammi per microlitro funziona bene. Una volta determinata la concentrazione ottimale, si raccomanda di diluire l'intero stock di plasmide purificato fino a una concentrazione predeterminata, piuttosto che preparazioni singole.

Quest'ultimo metodo potrebbe introdurre una certa variabilità nei tassi di successo, probabilmente a causa di variazioni nella purezza e in altri parametri, come la proporzione di plasmide a superelica. Per preparare le uova da sottoporre a microiniezione, le uova di pollo incubate mantenute con l'asse maggiore in posizione orizzontale fino allo stadio di sviluppo desiderato vengono tamponate con etanolo al 70% e lasciate asciugare. Successivamente, praticare un foro all'estremità appuntita dell'uovo utilizzando forbici chirurgiche. Con una siringa da 10 millilitri e un ago da 19 gauge, aspirare due millilitri di albume dall'uovo, quindi sigillare i fori con paraffina fusa prima dell'iniezione.

Utilizzare forbici chirurgiche per aprire una finestra nella parte superiore del guscio dell'uovo, in modo da impedire che detriti entrino nel foro. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla finestra e praticare un foro attraverso di esso. Per facilitare la visualizzazione dell'embrione, utilizzare una pipetta capillare tirata a fiamma montata su un aspiratore per iniettare un inchiostro non tossico, come il pelican 17, al di sotto dell'epiblasto.

Successivamente, accedere all'embrione tagliando e spostando le membrane vitellina e/o amniotica utilizzando perni per insetti da 0,14 millimetri montati su un portaaighi per caricare il DNA nella pipetta tirata Eloqua e aggiungere una piccola quantità di polvere di verde brillante mediante il capillare. Aspirare una minima quantità di plasmide tramite un capillare di diametro adeguato collegato a un aspiratore. Quindi inserirlo nell'estremità della pipetta opposta alla punta affilata e caricare il DNA il più vicino possibile all'estremità affilata.

Successivamente, collegare la pipetta a un iniettore manuale a pressione d'aria montato su un micromanipolatore. Applicare una quantità minima di pressione, se necessario, per consentire alla soluzione plasmidica di raggiungere la punta della pipetta. Introdurre la pipetta nel mezzo liquido dell'uovo esercitando una leggera pressione d'aria per evitare l'occlusione della punta della pipetta.

Una volta perforato il dominio tissutale rilevante, il cambiamento di pressione è spesso sufficiente per rilasciare il plasmide insieme al verde brillante visibile. Se ciò non avviene, applicare una leggera pressione sulla siringa finché non viene espulsa la miscela di plasmide e verde brillante. Ripetere questa procedura lungo l'asse dell'embrione; se necessario, può essere aggiunto PBS per l'iniezione.

Infine, sigillare la finestra con del nastro adesivo e reinserire le uova nell'incubatore. Evitare la ventilazione e inserire nell'incubatore piccoli contenitori di acqua per aiutare a mantenere l'umidità e aumentare i rendimenti. Se il sito bersaglio dell'iniezione era sufficientemente superficiale da essere chiaramente visibile, come nei somiti dorsali, nel tubo neurale o nell'ectoderma, è possibile misurare il tasso di successo dell'esperimento effettuando un'osservazione su preparato intero utilizzando un binocolo fluorescente.

Questo passaggio è particolarmente utile per valutare se un numero eccessivo o insufficiente di cellule è stato marcato. Se si desidera un'ulteriore incubazione, aggiungere al campione una soluzione di PBS contenente antibiotici e sostituire il nastro superiore. Inoltre, è possibile valutare il tasso di successo dell'iniezione mediante sezionamento seriale degli embrioni ed esecuzione di immunohistochimica.

Dopo quattro ore o più, gli embrioni vengono fissati e processati per la sezione in paraffina. Le sezioni montate su vetrino sono quindi deparaffinate e immunomarcate per l'amplificazione della visualizzazione del reporter, metodi come la biotina-streptavidina potrebbero essere desiderabili. Infine, le sezioni seriali vengono analizzate per rilevare le cellule marcate nei segmenti iniettati.

Se nei primi tentativi si ottengono cellule multiple anziché singole, la scorta del plasmide deve essere diluita e il procedimento ripetuto finché non si raggiungono risultati adeguati. Di norma, eseguiamo un'iniezione singola di P-C-A-G-G-F-P per acaro, mirando da sei a dodici segmenti per embrione. In queste condizioni, un segnale chiaro può essere rilevato mediante osservazione su preparato intero otto ore dopo l'iniezione, in almeno un segmento di un embrione su dieci.

In questo esempio, un singolo blastomero è stato iniettato con un plasmide codificante per la GFP e, cinque ore dopo, viene osservata una singola cellula fluorescente in una vista in preparato intero dell'embrione mostrata qui. Quando si osserva 24 ore dopo l'iniezione nel blastomero centrale, si nota una popolazione clonale di cellule fluorescenti in un embrione montato in toto due giorni dopo l'iniezione clonale. La sezione di questo segmento rivela la presenza di progenie clonale sia nel derma che nel muscolo, dimostrando che singoli progenitori generano entrambe le derivazioni.

Per quanto riguarda i somiti, singoli progenitori dell'epitelio neuroectodermico nel tubo neurale dorsale possono essere anch'essi impalati, come illustrato in questa sezione trasversale, fotografata cinque ore dopo l'iniezione. Un'analisi mediante sezioni seriali ha rivelato che si ottenevano trasfezioni clonali quando il tasso di successo era circa del 10%. Ciò significa che, per ottenere la clonalità, la tecnica è per definizione altamente inefficiente. D'altro canto, in queste condizioni, più del 93% degli eventi di marcatura positivi si è rivelato essere clonale.

Abbiamo appena mostrato come iniettare singole cellule di embrioni di pollo durante questa procedura. È importante ricordare di diluire una grande quantità di plasmide stock a una concentrazione ideale per le infezioni di singole cellule, e poi utilizzarla in tutti i vostri esperimenti. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.