Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l'induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

L'ipofisite autoimmune è caratterizzata da un ingrandimento della ghiandola pituitaria e da una carenza di uno o più ormoni ipofisari. Gli autoantigeni responsabili rimangono sconosciuti. In questo studio viene illustrato un protocollo per la preparazione di proteine della ghiandola pituitaria di topo da utilizzare nello studio di questa malattia.

Per prima cosa, le ghiandole pituitarie vengono isolate da topi sacrificati. Le pituitarie vengono quindi omogeneizzate per rompere meccanicamente le cellule e rilasciare le proteine citosoliche. L'omogenato viene chiarificato mediante centrifugazione a bassa velocità e quantificato mediante saggio colorimetrico BCA, mentre la qualità viene valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide.

Infine, l'omogenato proteico acquoso viene mescolato con un adiuvante oleoso. Questa miscela viene quindi iniettata nei topi per creare un modello murino che assomiglia all'ipofisite autoimmune. Come mostrato nel video allegato, sono state descritte quattro tecniche per indurre l'ipofisite in animali sperimentali.

La tecnica presentata in questo articolo, che consiste nell'iniezione di una miscela di proteine ipofisarie con l'adjuvante influenzale, è la più antica, risalente agli anni '60. Altri approcci includono l'iniezione di glicoproteine solubili del virus della rosolia nel 1992, l'iniezione stereotassica di un adenovirus direttamente nella ghiandola pituitaria nel 2002 e il trapianto della ghiandola pituitaria da una linea di ratti sotto la capsula renale di un'altra linea di ratti nel 2010. Il principale vantaggio dell'approccio con l'adjuvante di Florence è che attualmente è meno invasivo, più consistente e soprattutto più preciso nell'indurre una malattia che assomiglia strettamente alla controparte umana.

Sebbene riportata fin dagli anni '60, la tecnica con adiuvante estraneo ha dato scarsi risultati nell'induzione di ipofisite. Quando ho iniziato il mio dottorato, riuscivo a ottenere solo un'incidenza e una gravità modeste di ipofisite utilizzando il protocollo con adiuvante estraneo pubblicato. Le cose sono migliorate in modo significativo quando ho avuto l'idea di aumentare di dieci volte la quantità di proteine pituitarie contenute nell'emulsione EM.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi dell'ipofisite autoimmune, può anche essere utilizzato per studiare altre malattie autoimmuni per le quali gli autoantigeni devono ancora essere identificati. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà principalmente nell'ultimo passaggio, la preparazione dell'emulsione, poiché richiede abilità manuali, tempo e dedizione. Una dimostrazione visiva è quindi fondamentale per comprendere come deve essere preparata correttamente un'emulsione.

Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre il campo dell'autoimmunità. Sapere come preparare l'antigene in vitro per l'immunizzazione può essere utile anche nella produzione di anticorpi monoclonali o per testare nuovi vaccini. A dimostrare questa tecnica saranno S. Zoo Heroic Ura e Mayland al Gato del mio laboratorio.

La ghiandola pituitaria del mouse è una ghiandola di forma cilindrica situata alla base del cranio, in una depressione dell'osso sfenoidale chiamata fossa pituitaria. La ghiandola è delimitata lateralmente dai nervi trigemini e anteriormente dal chiasma ottico. È composta da un lobo anteriore più grande e da lobi intermedi e posteriori più piccoli.

Per isolare la ghiandola pituitaria, utilizzare le forbici per decapitare il topo eutanasizzato, quindi effettuare dei tagli paralleli dalla parte posteriore a quella anteriore del cranio. Sollevare il cervello e ribaltarlo all'indietro per esporre la ghiandola pituitaria, che appare come un cilindro situato all'interno di un triangolo isoscele avente la ghiandola pituitaria come base, i nervi trigemini come lati e il chiasma ottico come vertice.

Circondare la ghiandola con le punte delle pinzette chiuse per rompere le meningi circostanti. Quindi, utilizzando pinzette fini, afferrare l'ipofisi dalla cella di Turca e posizionarla in un tubo di plastica su ghiaccio secco. Per una preparazione, raccogliere 300 ghiandole ipofisarie di topo.

Questa raccolta richiede circa nove ore-uomo. Una volta completata la raccolta, conservare le ghiandole pituitarie a meno 80 gradi Celsius fino al momento del loro utilizzo. Posizionare un tubo Falcon da 15 millilitri in un bagno di ghiaccio.

Aggiungere al tubo 250 microlitri di buffer di omogeneizzazione. Per ogni 100 ipofisi raccolte subito prima dell'omogeneizzazione, aggiungere le ghiandole pituitarie di topo nel buffer. Successivamente, posizionare la punta dell'omogenizzatore Polytron, con un generatore dal diametro di cinque millimetri, sul fondo del tubo Falcon contenente le pituitarie di topo e il buffer, e omogeneizzare alla massima velocità per 30 secondi.

Muovere delicatamente il tubo su e giù mantenendolo sul ghiaccio. Successivamente, lasciare l'omogenato in ghiaccio per un minuto. Ripetere i passaggi di omogeneizzazione e raffreddamento altre due volte.

Questa omogeneizzazione delicata dovrebbe rompere le cellule e rilasciare le proteine senza frammentare i nuclei. Centrifugare l'omogenato a bassa velocità, circa 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, per far sedimentare i nuclei, il tessuto non rotto e i materiali insolubili come il tessuto connettivo e i complessi proteici denaturati. Fare attenzione a non disturbare il pellet.

Trasferire il SNA, ora chiamato post nuclear sate o PNS, in un nuovo tubo Falcon. Mantenere il PNS sul ghiaccio, recuperare il pellet utilizzando lo stesso volume di buffer di omogeneizzazione usato in precedenza, omogeneizzare e centrifugare come in precedenza. Dopo aver unito i due campioni di PNS, aliquotare la soluzione in numerosi tubi da microcentrifuga.

Conservare le provette da microcentrifuga a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Questa preparazione proteica è stabile a meno 80 gradi Celsius, ma perde gradualmente la sua potenza. Pertanto, si raccomanda di utilizzarla entro sei mesi dalla preparazione.

Conservare un'aliquote piccola del PNS per determinare il rendimento e la concentrazione proteica mediante saggio dell'acido bicinconico. Quindi determinare la qualità delle proteine mediante elettroforesi su gel da 300 ghiandole pituitarie di topo, il cui peso totale medio è di circa 570 milligrammi. Ci si aspetta un rendimento di 60 milligrammi di proteine pituitarie, ovvero un milligrammo di proteina ogni 10 milligrammi di tessuto.

La concentrazione proteica è tipicamente di circa 40 milligrammi per millilitro. L'esempio fornito qui riguarda l'immunizzazione di 10 topi. Si prevede di iniettare a ciascun topo 100 microlitri di emulsione contenente un milligrammo di proteina pituitaria; considerando due topi aggiuntivi per le perdite di materiale durante la preparazione, vengono preparati 12 milligrammi di emulsione proteica.

Iniziare scongelando rapidamente gli aliquote proteiche congelate riscaldandole tra le mani. Regolare la concentrazione proteica a 20 milligrammi per millilitro con PBS. Successivamente, aspirare 600 microlitri di estratto proteico ipofisario corrispondenti a 12 milligrammi in una siringa Hamilton da 2,5 millilitri e risospendere completamente l'adjuvante FRONS o CFA contenente cinque milligrammi per millilitro di Mycobacterium tuberculosis ucciso per calore, agitandolo manualmente.

Poi aspirare 600 microlitri di CFA in un'altra siringa Hamilton da 2,5 millilitri. Applicare e fissare un ago microemulsionante da 22 gauge sulla siringa riempita con CFA. Spingere lentamente lo stantuffo in modo che l'ago si riempia di CFA.

Quindi collegare e fissare l'altra estremità dell'ago alla seconda siringa contenente l'estratto proteico ipofisario. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno delle siringhe. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa contenente CFA per immettere la componente oleosa nell'estratto ipofisario acquoso, in modo che ne venga miscelata solo una piccola quantità.

Quindi reinserire lo stantuffo della siringa contenente l'estratto ipofisario nella siringa contenente l'adjuvante completo di Freund (CFA). Ripetere questa operazione aumentando gradualmente la quantità di materiale miscelato fino a quando tutto il contenuto non sarà completamente omogeneizzato. Questo materiale di colore biancastro e uniformemente distribuito rappresenta l'emulsione acqua-olio.

Una volta formata l'emulsione, ripetere l'intero ciclo avanti e indietro almeno 500 volte. Al termine dell'ultimo ciclo, le siringhe conterranno un'emulsione acqua-olio in rapporto uno a uno, in cui la concentrazione della proteina pituitaria è ora di 10 milligrammi per millilitro. L'emulsione è pronta per l'uso; per verificare la qualità dell'emulsione, aggiungere una goccia in un becher contenente acqua. Se l'emulsione è stata preparata correttamente, la goccia rimarrà compatta e ben definita sulla superficie.

Se l'emulsione è di scarsa qualità, si diffonderà e si dividerà in gocce più piccole. L'emulsione viene iniettata nello stesso giorno della sua preparazione nei topi SJL per indurre ipofisite autoimmune sperimentale. Questo protocollo è descritto in dettaglio nel jo verticale allegato.

Dopo aver raccolto la ghiandola pituitaria e aver acquisito padronanza delle tecniche, è possibile eseguire l'istruzione proteica in un'ora, ricordando di lavorare rapidamente e al freddo. Durante questa fase, durante la preparazione dell'immersione, che richiede circa un'ora. Ricordare di lavorare con lentezza e pazienza nella fase iniziale di mescolamento, dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare i meccanismi attraverso cui i linfociti autorreattivi riconoscono e infiltrano l'organo bersaglio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un estratto proteico dalla ghiandola pituitaria del topo e di come mescolarlo con gli adiuvanti di Freund per preparare un'emulsione pronta per essere utilizzata come immunogeno. Non dimenticare che lavorare con siringhe e adiuvanti completi di Freund, che contengono micobatteri della tubercolosi inattivati e liofilizzati, può essere pericoloso se accidentalmente ti pungi.

Pertanto, utilizzare sempre aghi sterili e smaltire correttamente gli aghi durante l'esecuzione di questa procedura.