Testing Protozoacidal di Ligand-litica Peptidi Contro Gut Termite protozoi In vitro (Cultura protozoi) e In vivo (Microiniezione in Termite hindgut)

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare che un ligando sintetizzato si lega specificamente ai protozoi digerenti la cellulosa nell'intestino delle termiti sotterranee di Formosan, e che il ligando associato a un peptide litico uccide questi protozoi in vitro in colture anaerobiche di protozoi e in vivo mediante iniezione nel proctodeo della termite. Ciò viene ottenuto innanzitutto estraendo i protozoi intestinali delle termiti operaie in condizioni anaerobiche. Il secondo passaggio della procedura consiste nel confermare il legame di un ligando marcato con un fluorocromo ai protozoi intestinali delle termiti in vitro.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel dimostrare che il peptide litico accoppiato al ligando uccide in vitro i protozoi dell'intestino delle termiti. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'iniezione nel retto della termite di un ligando marcato con fluorescenza e di un peptide litico accoppiato al ligando, al fine di confermare il legame e la distruzione dei protozoi intestinali in vivo. Mediante iniezioni di colture di protozoi nel retto della termite e l'utilizzo della microscopia a fluorescenza, dimostriamo che un ligando accoppiato a un peptide litico si lega e uccide in modo efficiente i protozoi intestinali delle termiti sia in vitro che in vivo.

L'associazione del ligando al peptide litico ha aumentato la tossicità nei confronti dei protozoi rispetto al peptide litico da solo. Sebbene abbia ridotto la tossicità verso organismi non bersaglio come E. coli, molto probabilmente perché il ligando non si lega alla membrana cellulare batterica, la perdita dei protozoi porta alla morte delle termiti in meno di due settimane. La tecnica presentata, che utilizza peptide colitici con ligando per eliminare i protozoi simbiotici nell'intestino delle termiti sotterranee, fa parte degli sforzi volti a sviluppare metodi alternativi per il controllo delle termiti.

Con una minore dipendenza da sostanze chimiche in assenza dei simbionti nel loro intestino, le termiti muoiono. Estraiamo i protozoi dall'intestino delle termiti per dimostrare che il ligando si lega ai protozoi e che il peptide lirico ligando uccide i protozoi. Le particelle di legno all'interno dei protozoi mostrano autofluorescenza. È quindi importante confrontare i risultati dei protozoi trattati con il ligando fluorescente con quelli dei protozoi non trattati.

Per evitare falsi positivi, iniettiamo direttamente i peptidi nell'intestino posteriore poiché, se somministrati per via orale alle termiti, le proteasi del mesenterio e dell'intestino anteriore li digerirebbero. Utilizzando librerie di visualizzazione Farge di New England Bio Labs, abbiamo identificato 19 sequenze di peptidi HEP che si legano ai protozoi. Abbiamo selezionato uno dei ligandi con una sequenza peptidica che mostrava analogie con glicoproteine putative note nella membrana di *Trypanosoma brucei*.

Dopo la sintesi del peptide, abbiamo accoppiato il peptide sintetizzato a una sonda fluorescente in posizione C-terminale mediante una sintesi peptidica allo stato solido, utilizzando la resina E-D-A-N-S novatech, al fine di valutare le proprietà litiche dei coniugati peptidici. In questo procedimento, si utilizza un coniugato del ligando sintetizzato e del peptide litico ate, precedentemente sintetizzato presso la struttura per la produzione di proteine della LSU un giorno prima dell'esperimento. Utilizzare il sigma coat per trattare tutti i materiali impiegati e prevenire l'assorbimento di protozoi o peptidi sulle superfici.

Applicare uno strato uniforme e lasciare asciugare tutta la notte prima di utilizzarlo il giorno successivo. Preparare una scatola a ventola all'interno di una camera a gas inerte per far circolare costantemente l'aria a temperatura ambiente attraverso una colonna di disidratante e una pila di catalizzatori di tipo D, al fine di ridurre l'umidità e i livelli di ossigeno per oltre un'ora. Riempire la camera a gas inerte con un flusso continuo di azoto per 20-30 minuti ed utilizzare ulteriore azoto per mantenere le condizioni anaerobiche quando necessario.

Successivamente, preparare il mezzo Traeger U e regolare il pH a sette. Spurgare il mezzo sterilizzato al filtro nella cappa anaerobica utilizzando una punta da 200 microlitri collegata a un tubo contenente una miscela di 2,5% idrogeno, 5% anidride carbonica e 92,5% azoto per un'ora, al fine di rimuovere le tracce di ossigeno dalla cappa. Una volta pronti i materiali, utilizzare una pinzetta per prelevare un operaio di termite da una piastra di Petri ed immergere l'intero corpo in un becher riempito con etanolo al 70%, tenendo il termite con la pinzetta per circa 10 secondi. Per rimuovere i contaminanti superficiali, estrarre l'operaio dall'etanolo e lasciarlo asciugare su un fazzoletto Kim pulito per circa 20 secondi.

All'interno della camera a gas inerte, preparare un vetrino silanizzato con 100 microlitri di mezzo Trager U per il prelievo dell'intestino della termita e una provetta contenente 900 microlitri di mezzo Trager U per la raccolta dei protozoi. Quindi, utilizzando un microscopio stereoscopico e una coppia di pinzette sterili con punta fine, tenere l'addome dell'operaio e afferrare la punta dell'addome con un'altra coppia di pinzette per estrarre delicatamente l'intestino verso l'alto o verso il basso con un angolo di 45 gradi, cercando di raccogliere quattro intestini, compresi il mesenterio, l'intestino medio e l'intestino posteriore, in un unico pezzo. Posizionare gli intestini delle termiti in una goccia di 100 microlitri di mezzo Trager U su un vetrino microscopico.

Passare al vetrino successivo, perforare gli intestini posteriori con una coppia di pinzette da dissezione sterili e fini per liberare i protozoi e trasferire delicatamente il contenuto intestinale con una pipetta da 200 microlitri in un tubo microcentrifuga da un millilitro contenente 900 microlitri di mezzo Traeger. Attendere cinque secondi per consentire la sedimentazione dei frammenti della parete intestinale e trasferire 900 microlitri del soprannatante in un tubo nuovo. Trasferire dieci microlitri di coltura di protozoi su un microscopio rivestito in sigma.

Far scivolare e verificare le condizioni dei protozoi al microscopio con un'ingrandimento di 200 volte. Preparare colture di controllo di protozoi aerobici, tetra piriformis, ameba, ug, spazzino e paramecio, nonché una coltura notturna di e coli nel mezzo di coltura come raccomandato dal fornitore immediatamente dopo aver ottenuto i protozoi. Fissare i protozoi dell'intestino delle termiti e qualsiasi altro controllo di protozoi ed e coli con formaldeide al 10% a quattro gradi Celsius per 12 ore. Successivamente, centrifugare la soluzione di protozoi a 30 volte la forza di gravità per 10 minuti.

Scartare il soprannadante e lavare il pellet contenente i protozoi fissati due volte con un millilitro di mezzo Trager U; risospendere il pellet in un millilitro di mezzo Trager U. Incubare i microorganismi fissati per uno-due ore con 100 microlitri di una soluzione del ligando sintetizzato accoppiato al colorante fluorescente E-D-A-N-S, utilizzando una concentrazione finale di ligando di 50 micromolare disciolta in acqua. Osservare i microorganismi trattati con i ligandi e i controlli non trattati al microscopio fluorescente a un ingrandimento di 400 volte, con un assorbimento massimo a 341 nanometri e un'emissione nella regione blu a 471 nanometri.

Per valutare le proprietà litiche del peptide coniugato al ligando, pipettare sei aliquote di 198 microlitri di coltura di protozoi preparata come mostrato nella sezione tre in provette da 0,5 millilitri. Aggiungere due microlitri di una soluzione di peptide litico con ligando a 100 micromolar alle metà delle aliquote di coltura di protozoi dell'intestino del termite. Per ottenere una concentrazione finale di un micromolare, aggiungere due microlitri di acqua sterile come controllo all'altra metà delle aliquote.

Dopo un'ora, trasferire 10 microlitri di ciascun ceppo di protozoi su un vetrino. Confrontare la sopravvivenza dei protozoi trattati con peptidi litici coniugati a ligandi rispetto ai controlli mediante microscopio a 200 ingrandimenti, utilizzando un micropipettatore NGI PC per tirare le micropipette con un livello di calore a due stadi. Per ottenere una dimensione della punta compresa tra 20 e 30 micron, verificare la dimensione della punta misurandola al microscopio.

Utilizzando un micrometro, riempire un ago con circa 30 microlitri di un ligando marcato con fluorescenza 50 micromolare sospeso in acqua. Utilizzando una siringa collegata, riempire un altro ago con acqua come controllo. Collegare una micropipetta a un supporto e a un micromanipolatore. Fissare un ago al supporto del sistema di iniezione posizionato su un secondo micromanipolatore.

Impostare i parametri iniziali di iniezione su una durata dell'impulso di circa un secondo e una pressione di iniezione compresa tra 10 e 12 PSI. Successivamente, avanzare lentamente l'ago all'interno della micropipetta e iniettare la soluzione utilizzando un pedale dopo l'iniezione. Rimuovere la micropipetta e registrare la lunghezza della soluzione iniettata.

Utilizzando un calibro ventre, calcolare il volume iniettato a partire dai parametri noti della micropipetta e regolare la pressione e la durata dell'impulso per espellere 0,3 microlitri di soluzione. Successivamente, preparare 20 termiti per ogni trattamento da iniettare. Premere delicatamente l'estremità dell'addome con pinzette morbide per rimuovere eventuali escrezioni presenti nel retto.

Quindi immobilizzare le termiti operaie raffreddandole sul ghiaccio per cinque minuti mentre le termiti si immobilizzano. Preparare dei contenitori per le termiti operaie tagliando le punte di pipette da 100 microlitri. Utilizzando una lama di bisturi, tagliare la punta a una lunghezza di 10-12 millimetri, in base alle dimensioni delle termiti, e posizionarle in una provetta.

Con un tappo a vite, collegare il ricevitore al micro manipolatore. Posizionare una formica operaia su una piastra di Petri in posizione dorsale e aspirare la formica in senso cefalico nel ricevitore utilizzando una pompa a vuoto a azoto, in modo che l'estremità della formica sporga dal ricevitore. Tenendo con cura il ricevitore che contiene la termite, avanzare con il micro manipolatore l'ago riempito per inserirlo nell'ano della formica. Iniettare 0,3 microlitri del ligando marcato con fluorocromo o del controllo acqua.

Posizionare le termiti operaie iniettate con ligando o acqua in piatti di Petri separati contenenti carta da filtro inumidita e mantenerle per tutta la notte a 26 gradi Celsius con un'umidità relativa del 78%. Dopo 24 ore, estrarre gli intestini dalle termiti iniettate e raccogliere i protozoi come mostrato in precedenza. Osservare il legame del ligando nei protozoi provenienti da termiti iniettate mediante microscopia a fluorescenza per valutare le proprietà litiche dei peptidi litici coniugati al ligando in termiti vive.

Preparare i materiali per l'iniezione, l'equipaggiamento e le termiti come precedentemente eseguito per le iniezioni ed iniettare 0,3 microlitri di soluzione di peptidi lisi ligandi a 500 micromolari oppure acqua come controllo nell'intestino posteriore di 20 operaie di termiti. Dopo 24 ore, estrarre gli intestini aggiuntivi da diverse operaie e osservare il contenuto intestinale al microscopio con un ingrandimento di 200 volte non appena viene confermata la morte di tutti i protozoi nell'intestino delle termiti trattate. Mantenere le termiti trattate rimanenti e i controlli in piastre di Petri con carta filtro umida e osservare la mortalità giornalmente. Confermiamo che il ligando accoppiato a una sonda fluorescente si lega a tutte e tre le specie di protozoi, p. grassi, h. hartmanni e s. l. a.

Dal retto di quattro termiti sotterranee mosson, a densità non rilevabili, il legame del ligando avviene su tutta la superficie cellulare ed è concentrato nella regione anteriore dei protozoi lungo l'asse, vicino a un foglietto di microtubuli e al nucleo MP grass eye. Abbiamo inoltre rilevato fluorescenza in tutte le specie di protozoi aerobici liberi testate, il che suggerisce che il ligando si lega a strutture comuni ai protozoi. Mentre nessun legame del ligando è stato osservato per E. coli, un micromolare di ligando peptide litico ha ucciso tutte e tre le specie di protozoi presenti nell'intestino di Omo e di termiti operaie sotterranee, così come il protozoo libero Tetrahymena piriformis in vitro in meno di 10 minuti, mentre i controlli sono rimasti vivi.

Questa immagine mostra la progressiva perdita dell'integrità della membrana dei protozoi intestinali delle termiti trattati con peptide litico legato a un ligando. Non è stata osservata alcuna differenza nel numero di colonie di e coli tra i trattamenti con peptide litico legato a un ligando e acqua; tuttavia, il peptide litico senza ligando riduce notevolmente il numero di colonie di e coli. Questo suggerisce che l'aggiunta di un ligando al peptide litico protegge in una certa misura i microorganismi non bersaglio dalla lisi. L'iniezione di 0,3 microlitri di peptide litico legato a un ligando a concentrazione di 500 micromolari ha ucciso tutte e tre le specie di protozoi presenti nell'intestino delle termiti epigeiche e sotterranee entro 24 ore, e le termiti sono morte dopo 10 giorni quando è stato iniettato il peptide litico coniugato al ligando.

I protozoi e le termiti sono morti tre volte prima rispetto all'iniezione di peptidi litici non coniugati a ligandi, come mostrato in Husen e Colia 2009, suggerendo che il ligando aumenta l'efficienza citolitica dei peptidi litici nelle condizioni ottimali di coltura. Tutte e tre le specie di protozoi estratte dall'intestino di Omo. Le termiti sotterranee dovrebbero rimanere vive e in buona salute per almeno tre giorni.

Tuttavia, se residui di ossigeno rimangono nel mezzo, il movimento dei protozoi si arresta immediatamente. Se si utilizza un mezzo errato e la pressione osmotica all'interno delle cellule diventa troppo elevata, le membrane dei protozoi si gonfiano e i protozoi si rompono. Se la pressione osmotica all'interno delle cellule diventa troppo bassa o le membrane sono compromesse, i protozoi si raggrinziscono e si riducono. La fissazione dei protozoi facilita la rilevazione del legame del ligando marcato con un fluorocromo ai protozoi.

È difficile rilevare la fluorescenza e distinguerla dall'autofluorescenza delle particelle di legno quando i protozoi si muovono liberamente. Una volta padroneggiata questa tecnica, circa 30 termiti all'ora possono essere iniettate con l'aiuto di un assistente. Sebbene il peptide ligando colitico sia stato sviluppato per eliminare i simbionti protosomi nell'intestino dei termiti sotterranei, e quindi per il controllo dei termiti, potrebbe anche risultare utile per lo sviluppo di farmaci contro parassiti protosomi come slash mania, ponoma, te e odium, responsabili di numerose malattie nell'uomo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come ottenere e mantenere in coltura protozoi estratti dall'intestino delle termiti, su come mostrare il legame specifico di un ligando ai protozoi mediante microscopia a fluorescenza, su come dimostrare l'azione proto-suicida del peptide ligand colitic in vitro. E, ultimo ma non meno importante, su come iniettare peptidi nell'intestino del tumore delle termiti per una conferma in vivo.