Induzione e punteggio clinico dell'epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. E quello che vi mostrerò nei prossimi giorni è come indurre e monitorare l'EAE cronico recidivante, ovvero l'encefalomielite autoimmune sperimentale nei ratti DA.

Questo è un modello animale per la sclerosi multipla, o dovrei dire, uno dei modelli animali per la sclerosi multipla. È caratterizzato da una paralisi flaccida ascendente negli animali e da caratteristiche istologiche che ricordano la malattia umana. Pertanto, questa procedura richiederà diversi giorni.

Quindi, nel primo giorno, vi mostrerò come preparare l'emulsione genica con un omogeneato di midollo spinale rosso naive in adiuvante completo di Freund. Nel secondo giorno, vi mostrerò come immunizzare i ratti contro l'EAE, dopodiché attenderemo tra sette e quindici giorni per osservare i primi segni clinici in questi animali, momento in cui vi illustrerò le diverse fasi di progressione dell'EAE in animali diversi. Per prima cosa, vi mostrerò tutti i reagenti e i materiali necessari per preparare l'emulsione.

Quello che sto usando è l'adjuvante completo di Freund H37 Ra, ma questo, sebbene contenga già Mycobacterium tuberculosis, verrà integrato con quattro milligrammi per ml di ulteriore Mycobacterium tuberculosis H37 Ra liofilizzato. Per preparare questo batterio liofilizzato, devo metterlo su un vetrino e ridurlo in una polvere fine utilizzando la spatola. Una volta completata questa operazione, aggiungerò tali batteri all'adjuvante.

Quindi l'adjuvante è pronto. Il passo successivo consiste nel preparare il mio antigene. Preleverò quindi i midolli spinali di ratto D congelati a meno 80 gradi, e per mantenerli ben congelati li posizionerò su un piattino di bilancia contenuto nel ghiaccio secco; li preleverò uno alla volta e, utilizzando semplici lamette da rasoio, triterò i midolli spinali nei piattini di bilancia.

Ora aggiungerò l'adjuvante supplementato nel vortice. Mentre avviene la vorticosità, aggiungerò il mio midollo spinale poco per volta all'adjuvante, dopo aver mescolato completamente il midollo spinale all'adjuvante nel vortice. Proseguiremo con la vorticosità per ulteriori cinque minuti, e successivamente trasferiremo l'immersione preparata in cinque siringhe di vetro da 5 M.

Collegheremo due siringhe di vetro da 5 ml utilizzando un ponte da 16 G e spingeremo l'emulsione da una siringa all'altra il più velocemente possibile attraverso tale ponte. Dopo alcuni minuti, quando l'emulsione inizierà a indurirsi, passeremo a un ponte più piccolo, da 18 G, il che renderà l'emulsione ancora più densa. Successivamente, lasceremo l'emulsione all'interno delle siringhe con questo ponte, avvolte in un foglio di alluminio, durante la notte in frigorifero.

Ho pesato 30 milligrammi di Mycobacterium tuberculosis sulla carta pesante. Li ho trasferiti in un mortaio. E utilizzando un pestello, ho ridotto gli aggregati batterici in una polvere fine.

Ma non si vuole premere troppo forte con il pestello per non rompere i batteri. Quando i batteri sono aggregati all'inizio di una procedura, hanno un colore giallo beige. Se si ottiene una polvere sottile e fine, alla fine si avrà una polvere bianca, ed è proprio questo che si desidera; tuttavia, non si deve premere troppo forte per evitare di rompere i batteri.

Dopo averlo fatto, ho prelevato 10 ml di adiuvante completo di trans, assicurandomi che tutti i batteri fossero in sospensione. Ho aperto questo campione e versato interamente i 10 ml di adiuvante completo di trans nel mortaio, sopra il Mycobacterium tuberculosis disgregato. Ora trasferirò l'adiuvante completo supplementato in una provetta da 50 ml.

Ora prendo il mio adiuvante trans completo supplementato e lo metto in un tubo. Ovviamente, i batteri si trovano sul fondo del liquido e cercherò di trasferirne la maggior parte nel tubo. Tuttavia, se ne lascio alcuni nel mortaio, non sarà un grosso problema perché riutilizzerò questo mortaio senza pulirlo per preparare l'emulsione del midollo spinale.

Ecco i midolli spinali. Erano stati mantenuti congelati a meno 80. Ne ho pesati 10 grammi da aggiungere a 10 ml del mio adiuvante supplementato.

Quindi, quello che farò con questi midolli spinali, mantenendoli congelati il più a lungo possibile, è tagliarli finemente nelle capsule di bilancia utilizzando lame di rasoio. Per tritare molto finemente i midolli spinali, sono necessarie due lame di rasoio e una capsula di bilancia. Prendo quindi un midollo spinale, lo pongo nella mia capsula di bilancia e inizio a tagliarlo, coprendolo con la mano in modo da evitare che, essendo congelato, salti via; inizierà a scongelarsi rapidamente e ad attaccarsi al bordo della mia lama di rasoio. Raccolgo prima i pezzi più grandi.

Pertanto, utilizzo un'altra lametta per rimuoverlo e cerco di tritare il tessuto nel modo più fine e rapido possibile, in modo che non abbia il tempo di sciogliersi, poiché una volta fuso diventa molto più difficile da tagliare. È estremamente importante che il midollo spinale venga tritato completamente e molto finemente, perché più il tritamento è fine, più l'immersione sarà omogenea e maggiore sarà il numero di ratti che svilupperà la malattia in forma omogenea. È quindi fondamentale tritare molto, molto bene tutti quei midolli spinali.

Ora procederò a tritare ognuno di quei midolli spinali esattamente nello stesso modo finché non avrò terminato con l'intero quantitativo di 10 grammi di midollo spinale. Ora mescolerò leggermente il midollo spinale nel mortaio, al fine di raccogliere tutti i residui di Mycobacterium tuberculosis che potrebbero essere rimasti nel mortaio dopo aver completato l'aggiunta dell'adiuvante. Successivamente, metterò l'adiuvante sul vortex.

E mentre continuo a vorticare il tutto il più velocemente possibile, aggiungerò poco a poco il mio midollo spinale a questo adjuvante. Ora ho il mio adjuvante supplementato in vortice, e inizierò ad aggiungere, poco alla volta, il mio midollo spinale. Il motivo per cui aggiungo l'antigene, l'antigene A, molto lentamente all'adjuvante è perché stiamo preparando un'emulsione di acqua in olio.

Quindi l'adjuvante è costituito principalmente da olio minerale, e l'antigene è una soluzione in parti uguali. Quello che dobbiamo fare è mescolare lentamente l'antigene all'olio, in modo che ogni volta che lo aggiungiamo, l'olio ricopra completamente l'antigene. Se lo aggiungessimo tutto in una volta, non ricoprirebbe completamente l'antigene.

Ora ho aggiunto tutto il midollo spinale medio all'adjuvante sul vortice e ho posizionato il tubo sul vortice per farlo girare ancora per cinque minuti, in modo da assicurarmi che tutto sia completamente miscelato. Regolo la velocità in modo da ottenere il vortice più intenso possibile senza perdere troppo liquido dal bordo del tubo. Ora i cinque minuti aggiuntivi di vorticosità sono terminati e procederò ad arrestare il vortice e a trasferire il mio campione in siringhe di vetro.

Quindi ho assemblato la siringa completa. L'ho collegata al ponte di diametro maggiore e all'altra estremità del ponte ho collegato solo il corpo di un'altra siringa, e ora aggiungerò l'emulsione in questa siringa. Quindi ora, no.

Ora trasferirò tutto il liquido nella siringa inferiore, scollegherò quella superiore, completerò il montaggio della siringa superiore assicurandomi che non ci siano bolle d'aria né nella siringa inferiore né nel collegamento. A questo punto, ricollegherò le siringhe. Ora entrambe le siringhe sono collegate tra loro tramite questo collegamento.

Uno è pieno di immersione, l'altro è vuoto. Quello che farò ora è spingere il pistone di una siringa all'altra avanti e indietro il più velocemente possibile. Ora sostituirò il ponte di grande diametro con uno più piccolo, il ponte da 18 G.

Il ponte più piccolo renderà l'emulsione ancora più densa. Per cambiare i ponti, metto tutta l'emulsione in una siringa. Rimuovo la siringa vuota, verifico di non perdere nulla nel ponte, rimuovo il ponte, applico il nuovo, elimino tutte le bolle d'aria e ricollego l'altra siringa.

E ripeto la procedura; ora l'emulsione è molto più difficile da attraversare, e ho cura di non rompere questo ponte, che è molto fragile. Ripeto questa procedura con un altro set di siringhe finché ho emulsione nel mio tubo. Utilizzo quindi tante siringhe quante sono necessarie per consumare completamente l'emulsione.

Ora ho mescolato l'emulsione diverse volte, forse 10, 15 volte, ma varia a seconda dei lotti. E adesso sta diventando estremamente difficile da attraversare. E lo farò ancora un paio di volte, beh, o forse no.

Ora è davvero bloccato, quindi lo lascerò così. Altrimenti, c'è il rischio di rompere sia la siringa che il ponte. Quindi, quando smette di passare, se ciò accade molto presto, potrebbe significare che il ponte è ostruito.

Ma a questo punto, dato che l'ho mescolato almeno 10 o 15 volte, significa che l'emulsione è pronta. È molto densa, quindi è meglio non toccarla. Ora la avvolgerò nella carta d'alluminio e la metterò in frigorifero per tutta la notte.

Ieri abbiamo preparato l'emulsione con i midolli spinai rossi e abbiamo lasciato l'emulsione tutta la notte in frigorifero. Oggi la preleviamo e procederemo a iniettarne 200 microlitri per ratto alla base della coda. Ma prima di iniettarla, dobbiamo assicurarci che l'emulsione sia di buona qualità.

Quindi dovrebbe essere ancora solido, ed è ancora un bel solido. La crepa che si vede qui ci indica persino che si tratta di un bel solido, non separato in fasi, in due fasi, cosa che sarebbe negativa. Questa emulsione è quindi adatta all'uso.

Quindi ogni gabbia riceverà 200 microlitri della nostra emulsione. Per l'iniezione, utilizziamo siringhe da tre millilitri, ma ci assicuriamo di usare siringhe con attacco a baionetta, perché se usassimo siringhe con attacco scorrevole, l'emulsione è così densa che l'ago potrebbe staccarsi durante l'iniezione.

Quindi utilizzare sempre una siringa con blocco a vite. Per quanto riguarda l'ago, si cerca di utilizzare l'ago più piccolo possibile, ma con un'emulsione così densa, è necessario utilizzare un ago da 20 gauge. Dato che l'iniezione deve essere eseguita con grande precisione alla base della coda, si anestetizzano i ratti per alcuni minuti e si sfrutta il fatto che i ratti siano profondamente addormentati per contrassegnarli.

Utilizziamo forature alle orecchie, e ogni ratto viene identificato da un particolare schema di forature. A questo punto siamo pronti per iniettare i ratti, e somministreremo a ciascun ratto 200 microlitri di emulsione alla base della coda, segnando contemporaneamente le orecchie. Preparo l'emulsione nella siringa per iniezione solo per un ratto alla volta, perché spesso risulta molto difficile effettuare l'iniezione e devo premere con forza, e non voglio somministrare a un ratto più emulsione del necessario.

Quindi riempio la siringa solo per un hu alla volta. Per riempire la siringa, collego la mia siringa di iniezione in plastica al ponte che a sua volta è collegato alla siringa di vetro contenente l'emulsione. Introduco circa 300 microlitri di emulsione nella mia siringa di plastica.

Poi collego l'ago e spingo fuori l'aria dall'ago in modo da non perdere questi 50 microlitri persi nello spazio morto dell'ago. E mi assicuro di avere esattamente 200 microlitri, quindi inietto alla base della coda del ratto. Ora che abbiamo iniettato tutti i cuori, li monitoreremo quotidianamente.

Peseremo gli animali ogni mattina e controlleremo due volte al giorno la presenza di segni clinici di EAE. I primi segni, che vi mostrerò quando si presenteranno, saranno una coda floscia, e ci aspettiamo che questi segni compaiano nei primi ratti intorno al giorno sette, giorno otto dopo l'iniezione. La maggior parte dei ratti si ammalerà intorno al giorno 10-12, mentre gli ultimi si ammaleranno intorno al giorno 15-17.

Siamo ora al giorno 13 dopo aver immunizzato i nostri cuori con l'emulsione di midollo spinale, e ora controllerò quegli animali per verificare il loro punteggio clinico. Ma prima di farlo, permettetemi di presentarvi come ospitiamo i nostri animali. Le malattie autoimmuni hanno questa caratteristica: qualsiasi patogeno presente nell'animale ridurrà la risposta autoimmune.

Pertanto, per evitarlo al massimo, alleviamo i nostri ratti in condizioni specifiche. Li ospitiamo in questo cubicolo, che contiene aria filtrata ed è mantenuto sotto pressione positiva; gli animali stessi vengono allevati in gabbie sterilizzate con autoclave. Assolutamente tutto ciò che si trova nella gabbia viene sterilizzato con autoclave prima di introdurre il ratto.

E hanno filtri sulla parte superiore delle gabbie. Il cibo è il comune mangime per roditori. È I originato.

E forniamo anche acqua acidificata ai nostri ratti. Prendiamo acqua potabile normale e aggiungiamo acido cloridrico seguendo protocolli standard, utilizzando l'acqua acidificata per mantenere la flora intestinale al minimo, riducendo così il rischio di compromettere la risposta autoimmune. Ora sono pronto per effettuare la valutazione clinica dei miei ratti.

Il punteggio varia da un valore di zero, che corrisponde all'assenza di segni clinici, a sei, che indica uno stato morboso grave, nel qual caso gli animali vengono sacrificati. Ora vi illustrerò passo dopo passo esempi di ciascun punteggio clinico riscontrabile in questo modello. Siamo attualmente al giorno 13 dopo l'immunizzazione dei ratti con UCAE.

E in quella gabbia ho due ratti che non si sono ancora ammalati. Quindi non presentano assolutamente alcun segno clinico di malattia. Pertanto, entrambi i ratti sono ancora sani.

Si muovono in giro, corrono avanti e indietro, e come potete vedere, quando si spostano sollevano la coda dal fondo della gabbia. A volte lasciano asciugare la coda, ma nella maggior parte dei casi cercano di tenerla sollevata dal fondo. E se ne hanno l'opportunità, cercheranno anche di arrampicarsi fuori dalla gabbia, il che significa che hanno il pieno controllo di tutte e quattro le zampe e possono stare in piedi se necessario.

Il primo segno clinico della EA è quindi una coda floscia. Quindi, se prendo un ratto e premo il dito contro la coda, il ratto tenderà ad afferrare con la punta della coda. Come avete appena visto, questo ratto non ha una coda floscia, e posso verificarlo anche con l'altro.

La coda afferra il dito, il che significa che questi ratti hanno una coda completamente reattiva. Hanno un punteggio clinico pari a zero, il che indica effettivamente l'assenza totale di sintomi. Ecco quindi un ratto con un punteggio clinico di O 0,5.

Quindi, se si osserva semplicemente nella gabbia, l'animale si comporta in modo assolutamente normale: corre in giro, si arrampica lungo i lati della gabbia, ma la punta della coda non si stacca mai dal fondo. Questo ratto potrebbe avere una parziale paralisi della coda. Quindi, quello che faccio è afferrare il ratto ed eseguire lo stesso test; anche se la coda presenta un certo tono, l'estremità non si arrotola completamente attorno al mio dito.

Assegnerò quindi a questo ratto un punteggio di 1,5, che corrisponde a parziale rigidità della coda. Un punteggio clinico di 1 è caratterizzato da coda completamente flaccida, ovvero nessuna parte della coda presenta tono muscolare, ma l'animale riesce ancora a utilizzare normalmente gli arti posteriori. Come si può vedere, questo ratto si sta appoggiando contro il fianco della gabbia, segno che le zampe posteriori funzionano correttamente.

Ma se controllo la coda di quei ratti sollevandoli, non c'è assolutamente tono nella loro coda. Un altro test che si può eseguire consiste nel sollevare la coda con un RU normale mentre l'RU si trova sul fondo della gabbia: la coda scenderà lentamente o magari non raggiungerà nemmeno il pavimento con un punteggio di uno. Se si solleva la coda, questa cadrà immediatamente a terra.

Questo RU può muovere tutte e quattro le membra, ma gli arti posteriori sono troppo deboli per permettere a questo RU di stare in piedi. Pertanto, classificherò questo RU con un punteggio clinico di due. La differenza principale tra un punteggio di uno e di due è che il punteggio di uno corrisponde esclusivamente a una coda floscia.

Le zampe posteriori sono completamente funzionali e, con un punteggio di tre, il ratto cadrebbe sul fianco. Il valore due è intermedio, quindi il ratto può utilizzare le zampe posteriori, ma queste sono molto più deboli rispetto a quelle di un ratto normale. Pertanto, questo ratto presenta una caratteristica insolita di EAE.

Normalmente l'EAE è caratterizzata da una paralisi flaccida ascendente, ma in alcuni casi, piuttosto rari, come questo, i ratti sviluppano prima la paralisi degli arti anteriori, seguita successivamente dalla paralisi degli arti posteriori. Questo è il caso di questo ratto. Se lo osservate, la sua testa è più bassa rispetto al resto del corpo perché ha difficoltà con gli arti anteriori e non riesce ad arrampicarsi sul bordo della gabbia.

E anche se gli arti posteriori funzionano normalmente, non riesce a spingere con gli arti anteriori. Pertanto assegnerei ancora a questo ratto un punteggio di due, che corrisponderebbe a una parasi lieve, anche se normalmente osserviamo questo fenomeno negli arti posteriori in questo ceppo, qui lo osserviamo in tutti e quattro gli arti. Quindi questo ceppo presenta un fenotipo molto più grave rispetto ai precedenti.

Presenta un punteggio clinico di tre. Come vi mostrerò, gli arti anteriori funzionano assolutamente in modo normale, ma i due arti posteriori mostrano una paralisi moderata. Entrambi gli arti posteriori sono utilizzabili dall'RU per muoversi, ma l'RU cade di lato e non riesce a controllare completamente quelle zampe.

Queste spore stanno diventando molto più deboli di quanto lo sarebbero normalmente senza EE. A questo stadio, non ci preoccupiamo più dell'ipotonia della coda, poiché molti di questi ratti, dopo un po', cominciano ad avere una coda molto rigida. Questo ratto ha ancora una coda molto floscia, ma a volte si possono osservare segni di distonia. La coda, infatti, inizia a muoversi in modo non coordinato.

Quindi a questo livello non osserviamo più la coda, ma soltanto il funzionamento degli arti. Assegniamo un punteggio di 3,5 perché, osservando gli arti posteriori, uno si muove, mentre l'altro è completamente paralizzato e non contribuisce affatto al movimento in avanti del roditore. Pertanto, questa condizione è considerata una paralisi completa di un arto posteriore e, di conseguenza, un punteggio di 3,5.

Questo ratto ha un punteggio clinico di quattro, il che significa paralisi completa degli arti posteriori, ed è caratterizzato dall'incapacità totale di muovere le zampe posteriori. Il ratto presente in questa gabbia ha un punteggio clinico di cinque, il che corrisponde a una paralisi completa degli arti posteriori con incontinenza aggiuntiva. Questo animale è incontinente, come possiamo vedere, presenta un completo accumulo di peso in questa zona, cosa che non osserviamo negli altri animali che non sono incontinenti.

Quando i nostri HUS presentano punteggi pari a tre o superiori, forniamo loro bottiglie d'acqua con lunghi tubicini bevitore per assicurarci che possano accedervi. Inoltre, posizioniamo il cibo sul fondo della gabbia e forniamo anche confezioni di gel. Tuttavia, nonostante tutte queste misure, ogni volta che prendiamo i ratti per monitorarli, il che avviene due volte al giorno, offriamo sempre loro dell'acqua, nel caso non ne abbiano assunta una quantità sufficiente durante la giornata.

Qui ho un ratto con un punteggio clinico di quattro. A questo stadio, questi animali devono essere un po’ incoraggiati a mangiare. Quindi io inumidisco il loro cibo, il che rende molto più facile per loro masticarlo.

Nelle ultime due settimane, ti ho mostrato come indurre e monitorare l'EAE cronico recidivante nei ratti DA. Nel primo passaggio, ti ho mostrato come preparare l'immersione del midollo spinale, quindi come iniettarla alla base della coda di questi ratti. Oggi ti ho mostrato come assegnare punteggi ai ratti in base ai diversi livelli di malattia.

Certo, questo è un modello cronico recidivante, quindi ci aspettiamo che i ratti presentino punteggi variabili. La malattia andrà in remissione nel giro di pochi giorni e poi recidiverà nel tempo. Alcuni ratti entreranno in una fase più cronica della malattia.

Varierà da animale a animale. Ora, prima di concludere questo video, voglio sottolineare un aspetto relativo ai test farmacologici in questi modelli. Il punto molto importante è randomizzare gli animali nel modo più accurato possibile.

Una cosa molto importante da sapere è che quanto prima l'animale si ammala, tanto più grave sarà la malattia. Pertanto, non si devono raggruppare tutti gli animali di controllo nel primo giorno e gli animali trattati nei giorni successivi. Quello che facciamo è che non appena un animale si ammala e raggiunge il giorno in cui si desidera iniziare il trattamento, posizioniamo gli animali casualmente in due gruppi diversi.

Se abbiamo, ad esempio, un gruppo di controllo e un gruppo trattato, il primo cuore verrà assegnato al gruppo di controllo, il secondo al gruppo trattato, e così via fino a quando tutti gli animali saranno assegnati al proprio gruppo. Tuttavia, ci assicuriamo che questa randomizzazione avvenga il più presto possibile nel protocollo. Spero quindi che questo video ti sia stato utile e che tu sia in grado di indurre e monitorare l’EAE cronica recidivante nei ratti D.

In bocca al lupo per i vostri esperimenti.