Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare informazioni strutturali e stechiometriche riguardo a una proteina. Tutti i complessi di legame che esprimono cellule biologiche vive, le cellule di lievito vengono ingegnerizzate geneticamente per esprimere le proteine di interesse legate a una sonda fluorescente donatrice o accettore. Le sonde donatrici possono essere eccitate direttamente da un laser.

Mentre gli accettori possono essere eccitati solo tramite un trasferimento di energia da un donatore vicino eccitato, le cellule vengono esposte alla luce di un laser a impulsi nell'infrarosso vicino. La fluorescenza proveniente dalle sonde viene separata nelle sue componenti spettrali da un reticolo di trasmissione e proiettata sulla superficie di un array CCD a moltiplicazione elettronica. Pertanto, spettri fluorescenti completi provenienti da singoli legamenti, tutti quanti, vengono ottenuti per ogni posizione nel campione.

Il profilo spettrale della fluorescenza rilevata dipende dall'interazione specifica delle proteine di interesse. I dati vengono analizzati per determinare, per ciascun pixel dell'immagine di una cellula scansionata, le emissioni separate delle sonde donatrici e accettrici. L'efficienza del trasferimento di energia viene determinata in ogni pixel dell'immagine, quindi i pixel vengono raggruppati in base alla loro efficienza FRET e all'istogramma.

L'interpretazione dell'istogramma consente la determinazione in vivo delle proteine, delle dimensioni e della configurazione dei complessi. Ciao, mi chiamo Michael Stoneman del gruppo di ricerca Riku presso l'Università del Wisconsin Milwaukee. Il mio nome è Singh.

Sono del laboratorio di Rikus nel Wisconsin, Milwaukee. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i profili di emissione completi di centinaia di complessi del legamento all'interno di una cellula vengono ottenuti con una singola scansione completa della cellula. Tipicamente, la maggior parte dei metodi di microscopia a fluorescenza richiede che la cellula di interesse venga scansionata più volte per accumulare informazioni spettrali sufficienti al fine di determinare l'efficienza FRET in diverse regioni di interesse all'interno della cellula.

Tuttavia, le reazioni biochimiche di diffusione possono modificare la composizione molecolare di queste regioni di interesse, limitando così le informazioni ottenute nell'analisi dell'immagine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nello studio delle proteine e delle interazioni proteiche nelle cellule vive, come ad esempio: qual è la dimensione degli oligomeri dannosi? In quale fase del ciclo vitale della proteina si formano gli oligomeri, e quale ruolo svolgono gli oligomeri di questa proteina nella funzione cellulare?

Il microscopio a due fotoni con risoluzione spettrale accumula informazioni spettrali sui complessi olima nella cellula immagine, spostando il fuoco del fascio di eccitazione attraverso il campione di interesse in diverse posizioni. Una coppia di specchi di scansione ortogonali viene utilizzata per spostare il fuoco del fascio laser attraverso il campione in due direzioni diverse. Il movimento degli specchi di scansione è controllato da computer e sincronizzato con l'estrazione dei dati di intensità della fluorescenza dalla telecamera CCD; da queste scansioni lineari è possibile ricostruire mappe spaziali dell'intensità di fluorescenza corrispondenti a una particolare lunghezza d'onda della luce.

Per ricostruire con precisione le mappe spaziali dell'intensità della fluorescenza a raggi X e calcolare la lunghezza d'onda effettiva corrispondente a ciascuna di queste mappe, il protocollo di scansione lineare deve essere calibrato utilizzando una soluzione di fluoresceina. Per iniziare la procedura di calibrazione, inviare lo spettro di eccitazione a una lunghezza d'onda di 800 nanometri, pari a due volte la lunghezza d'onda di eccitazione massima del marcatore donatore GFP due due per inviare lo spettro di eccitazione, traslare il prisma situato all'interno della cavità laser per modificare la dispersione della velocità di gruppo utilizzando il programma informatico al quale è interfacciata la telecamera. Inviare un comando al chip CCD per ridurre la temperatura del chip CCD alla temperatura più bassa raggiungibile.

Al fine di ridurre il rumore scuro, pipettare 10 microlitri di soluzione di fluoresceina su un vetrino del microscopio coprendo con un coprioggetto in modo che uno strato sottile del campione sia uniformemente disperso nella regione tra il coprioggetto e il vetrino. Posizionare una piccola goccia di olio di immersione sulla superficie del coprioggetto. Fissare ora il vetrino del microscopio al piano di traslazione XY, Z e spostare il vetrino e il piano nella direzione dell'asse ottico regolando manualmente l'attuatore lineare, finché l'obiettivo del microscopio entra in contatto con la goccia di olio di immersione. Passare la telecamera a una modalità video di acquisizione dati in modo che la luce ricevuta che colpisce l'array CCD venga visualizzata in tempo reale sullo schermo del computer.

Spegnere tutte le luci ambientali della stanza per ridurre il rumore di fondo rilevato dall'array CCD. Regolare lentamente il micrometro che controlla la fase di traslazione nella direzione dell'asse ottico per portare il campione nel punto focale del fascio laser. Quando il campione di fluoresceina è a fuoco, l'emissione apparirà come una linea nitida sull'array CCD.

Scaricare il rilevamento delle intensità dei pixel dall'array CCD al computer. Misurare l'intensità dei pixel in funzione della posizione sull'array CCD aprendo nella ImageJ la matrice di valori di intensità scaricata e tracciando una linea attraverso la regione fluorescente. Utilizzare il comando image day.

Analizzare il profilo del grafico per creare un diagramma che illustri lo spettro di emissione del campione di fluoresceina. Regolare il parametro incrementale dello specchio, che controlla il movimento del laser. Mettere a fuoco nella direzione Y, in modo che posizioni adiacenti lungo y all'interno del campione determinino lo spostamento del picco degli spettri fluorescenti di esattamente un pixel lungo la dimensione spettrale dell'array CCD.

Per monitorare questo fenomeno, scaricare l'intensità degli spettri di fluoresceina per due diverse posizioni Y nel campione. Successivamente, aprire le immagini di intensità con ImageJ e individuare la posizione del pixel di picco per ciascuno degli spettri fluorescenti. Utilizzando il cursore di ImageJ, lasciando lo shuttér del CCD aperto, scansionare il fuoco del laser attraverso il campione nella direzione X.

La luce emessa da ciascun voxel lungo la linea della scansione dovrebbe incidere sull'array CCD alla fine di ogni linea di scansione, memorizzare i dati ottenuti dall'array CCD per questa scansione e quindi azzerare i pixel dell'array CCD. Spostare la posizione del laser. Mettere a fuoco nella direzione Y della quantità determinata in precedenza.

Quindi scansionare il fascio laser nella direzione X attraverso il campione. Ancora una volta, lasciare aperto lo scatto del CCD e memorizzare i dati. Ripetere questa procedura di scansionamento lineare fino a quando un'area fisica di circa il 50% più grande rispetto alle dimensioni di una singola cellula biologica è stata illuminata dalla luce laser.

La relazione tra il numero di riga di una particolare immagine di scansione a righe e la lunghezza d'onda deve essere utilizzata per ricostruire le immagini e ottenere diverse mappe facciali di intensità fluorescenti ex-wife a diverse lunghezze d'onda. Per ottenere l'immagine di emissione fluorescente ex-wife per una specifica lunghezza d'onda, individuare il numero di riga nell'immagine ottenuta dalla prima scansione a righe che corrisponde a tale lunghezza d'onda. Quindi, la riga adiacente nell'immagine successiva di scansione a righe corrisponderà alla riga successiva dell'immagine di emissione fluorescente.

Per quella particolare serie di lunghezze d'onda, raggruppare tutte le righe dell'immagine corrispondenti a tale lunghezza d'onda per ottenere le mappe spaziali di intensità fluorescente XY del campione a quella lunghezza d'onda. Ripetere questa procedura per tutte le altre lunghezze d'onda disponibili per raccogliere i dati sui campioni. In primo luogo, rimuovere dall'incubatore le piastre contenenti le colonie di lievito trasformate.

Dovrebbero essere presenti almeno tre tipi di cellule trasformate: cellule che esprimono le proteine di interesse marcate con entrambi i tipi di sonde fluorescenti, cellule che esprimono solo le proteine marcate con la sonda fluorescente donatrice e cellule che esprimono solo le proteine marcate con la sonda fluorescente accettrice.

Aggiungere 100 microlitri di cloruro di potassio 100 millimolare in una provetta da microcentrifuga. Quindi, utilizzando una punta da micropipetta, raschiare da tre a cinque colonie di lievito dalla piastra di cellule che esprimono proteine marcate sia con il donatore che con l'accettore di sonde fluorescenti e inoculare il cloruro di potassio 100 millimolare. Con queste cellule, prelevare 10 microlitri della sospensione cellulare e depositarli su un nuovo vetrino da microscopio.

Coprire la goccia con un coprioggetto e posizionare una goccia di olio sulla sua superficie. Successivamente, chiudere manualmente l'otturatore sul percorso del fascio laser per impedire alla luce laser di raggiungere l'obiettivo del microscopio. Fissare il vetrino alla piattaforma di traslazione XY, Z e spostare la piattaforma lungo la direzione dell'asse ottico fino a quando l'obiettivo del microscopio entra in contatto con la goccia di olio ad immersione.

Ora accendere l'illuminazione a campo luminoso e passare alla videocamera. Modalità di acquisizione dati in video. L'immagine a campo ampio del campione sarà fortemente sfocata a causa della presenza del reticolo di trasmissione nel percorso di emissione.

Pertanto, posizionare un filtro passa-banda con una piccola larghezza a metà altezza nel percorso ottico prima del reticolo di trasmissione. Tradurre lentamente la fase di traslazione nella direzione dell'asse ottico osservando l'immagine delle cellule sullo schermo della telecamera finché le cellule non vengono messe a fuoco. Spostare la fase nelle direzioni X o Y per portare una singola cellula nella posizione del fuoco del fascio laser.

Spegnere la sorgente di illuminazione a campo chiaro e rimuovere il filtro passa-banda dal percorso di emissione. Sbloccare il fascio laser per un breve periodo mentre si osserva contemporaneamente il segnale ricevuto dall'array CCD. Se un segnale fluorescente viene rilevato sull'array CCD durante il tempo in cui il fascio laser incide sulla cellula, eseguire una scansione completa di acquisizione dati fluorescenti di questa cellula.

È fondamentale utilizzare gli stessi parametri di scansione, in particolare il numero di linee e l'incremento di y determinati nella procedura di calibrazione illustrata in precedenza. Ripetere il processo di localizzazione cellulare e acquisizione dei dati di fluorescenza per un elevato numero di cellule che esprimono proteine legate sia ai marcatori donatori che a quelli accettori. Dopo aver accumulato un numero sufficiente di immagini di fluorescenza di cellule che esprimono proteine marcate con entrambi i recettori, ripetere l'intero processo sia per le cellule che esprimono soltanto proteine marcate con sonde fluorescenti donatrici sia per quelle che esprimono soltanto proteine marcate con sonde fluorescenti accettrici.

Infine, ricostruire tutte le scansioni per ottenere mappe spaziali dell'intensità fluorescente XY risolte spettralmente per ogni serie di dati, utilizzando la procedura descritta in precedenza. Le tre figure illustrate qui di seguito mostrano le mappe spaziali risultanti calcolate a partire da misurazioni di microscopia a due fotoni risolta spettralmente effettuate su una cellula di lievito che esprime il recettore per il fattore alfa sterile. Le mappe bidimensionali dei segnali del donatore e dell'accettore sono state ottenute analizzando i profili di emissione spettrale acquisiti da ciascuna posizione della cellula.

Alle intensità di fluorescenza vengono assegnati colori falsati in base ai loro valori, e la scala è mostrata come insetto. Una mappa bidimensionale delle efficienze apparenti di FRET è stata quindi calcolata utilizzando le immagini KDA e KAD, sulla base dei valori estratti dalla mappa delle efficienze apparenti di FRET della cellula; appena mostrata è stata preparata una rappresentazione istogramma. I valori misurati di EAPP della cellula sono rappresentati da cerchi.

La linea rossa continua rappresenta l'adattamento migliore ai dati misurati utilizzando la somma delle singole funzioni del calcio rappresentate dalle linee verdi continue. L'analisi dell'istogramma, descritta nel testo del protocollo, conferma che il complesso sterile del recettore del fattore alfa due con tutti i ligandi assume la forma di un tetramero a forma di RBA in vivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se effettuata correttamente.

Durante questo esperimento, è fondamentale mantenere bassa la potenza della sorgente di eccitazione. È importante evitare un'eccitazione multipla del donatore da parte di un singolo impulso.