Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Uno degli obiettivi più importanti nelle neuroscienze è comprendere i segnali molecolari che guidano le fasi iniziali della formazione delle sinapsi. Per questo motivo, è diventato fondamentale sviluppare approcci oggettivi per quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. Per quantificare il numero di sinapsi in diversi tipi di preparazioni sperimentali, i neuroni in coltura o sezioni crioconservate di tessuto cerebrale vengono colorati con marcatori selettivi pre- e post-sinaptici al fine di evidenziare i punti di contatto sinaptico tra i neuroni.

Le cellule o il tessuto vengono quindi osservati al microscopio a fluorescenza e sono richieste immagini a 8 bit per ciascuno dei canali corrispondenti ai due marcatori di immunohistochimica. Le immagini vengono analizzate utilizzando ImageJ 1.29 con il plugin Puncta Analyzer. Per determinare il grado di codistribuzione tra i marcatori presinaptici e postsinaptici, i punti di codistribuzione possono essere utilizzati per stabilire il numero di sinapsi presenti nel preparato.

Il principale vantaggio della tecnica qui descritta rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica, è che il saggio delle sinapsi consente un'analisi e una quantificazione del numero di sinapsi con un rendimento molto più elevato. Le principali implicazioni di questa tecnica riguardano la diagnosi e la terapia di disturbi clinici come la malattia di Alzheimer, l'epilessia o l'autismo, nei quali anomalie della connettività sinaptica sono state indicate come base della patologia sottostante. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare forme di intervento in grado di ridurre o attenuare le carenze osservate nella capacità dei neuroni colpiti di formare sinapsi tra loro.

Sebbene questo metodo sia utile per lo studio dello sviluppo cerebrale, può essere applicato anche ad altri organismi modello o sistemi organici in cui si desidera studiare o quantificare il numero di contatti tra cellula e cellula, a condizione che si abbia la capacità di etichettare selettivamente ciascuna faccia opposta di ogni sito di contatto. Preparare colture neuronali seminando cellule gangliari retiniche di ratto purificate dalla retina di ratto, ottenute da animali P5-P7, su coprivetri rivestiti con poli-d-lisina. In una piastra a 24 pozzetti, le cellule vengono lasciate crescere a 37 °C per tre-cinque giorni prima della trasfezione.

Dopo la trasfezione, incubare le cellule per ulteriori sette-otto giorni per consentire lo sviluppo delle sinapsi, quando le cellule seminate hanno raggiunto una maturazione sufficiente. Rimuovere il mezzo di coltura dai pozzetti e aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% preriscaldata in ciascun pozzetto, lasciando fissare per sette minuti. A temperatura ambiente, dopo la fissazione, risciacquare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato.

È fondamentale assicurarsi che le cellule non si secchino mai nei pozzetti. Una volta rimosso un buffer da un pozzetto, esso deve essere immediatamente sostituito con il buffer successivo. Preparare il buffer di blocco contenente siero di capra normale al 50% e Triton X-100 allo 0,2%.

Dopo aver rimosso il PBS da ogni pozzetto, aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante in ogni pozzetto e bloccare per 30 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione bloccante e lavare tre volte con PBS. Preparare una diluizione dell'anticorpo primario in una soluzione contenente il 90% di tampone per anticorpi e il 10% di soluzione NGS, contenente la coppia di anticorpi pre- e post-sinaptici scelta.

Qui vengono utilizzati un antisiero di coniglio anti-sinapsina, un marcatore pre-sinaptico, e un anticorpo murino anti-homer, un marcatore post-sinaptico. Centrifugare la soluzione dell'anticorpo primario per cinque minuti alla velocità massima in una centrifuga da banco per rimuovere qualsiasi anticorpo precipitato, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione dell'anticorpo primario a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un contenitore umidificato per evitare l'essiccazione della soluzione primaria.

Incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione con l'anticorpo primario. Lavare ogni pozzetto tre volte. Aggiungere 200 microlitri degli anticorpi secondari appropriati, diluiti uno a 1000 in buffer per anticorpi contenente NGS al 10%, preparato in PBS.

Come in precedenza, posizionare la piastra nella camera umidificata e incubare per due ore a temperatura ambiente al buio, dopo l'incubazione con i secondari. Risciacquare ogni pozzetto da tre a quattro volte con PBS. Applicare una goccia di mezzo di montaggio Vector Shield con DPI su un vetrino.

Quindi capovolgere il vetrino con le cellule sulla goccia per effettuare il montaggio. Infine, applicare uno smalto trasparente lungo i bordi del vetrino coprioggetto. Prestare attenzione a non spostare o muovere i vetrini coprioggetto durante l'applicazione.

Dato che questa procedura condividerà le cellule, lasciare asciugare i vetrini per almeno 30 minuti in un luogo asciutto e al buio. In questo caso, l'analisi mediante imaging viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza Zeiss Axio Imager dotato di appositi set di filtri e di un obiettivo ad immersione in olio da 63 volte. Posizionare un vetrino contenente cellule non trasfettate sul palchetto del microscopio.

Utilizzando il set di filtri DPI per visualizzare i nuclei cellulari, selezionare cellule che si trovano a una distanza di almeno due diametri cellulari rispetto ai loro vicini più prossimi. L'uso del DPI in questo passaggio aiuterà a evitare bias e garantirà la casualità nella selezione delle cellule. Per ciascuna cellula selezionata, acquisire immagini a 8 bit utilizzando i set di filtri appropriati, in questo caso GFP e Texas Red.

L'immagine sovrapposta con colorazione finta deve mostrare i marcatori pre- e post-sinaptici rispettivamente in rosso e verde. Successivamente, posizionare sul portapreparati del microscopio un vetrino contenente cellule trasfettate. In questo caso, le cellule sono state trasfettate con un vettore di espressione di TD-tomato.

Utilizzare questo marcatore per selezionare le cellule come in precedenza. Per ogni cellula selezionata, acquisire otto immagini dei piatti utilizzando i set di filtri appropriati, in questo caso GFP, Texas Red e Sci five. L'immagine sovrapposta con colorazione finta deve mostrare i marcatori post-sinaptici in rosso, verde e blu.

Qui, il programma analizzatore di puntini viene utilizzato per la quantificazione dei puntini sinaptici co-localizzati. Il plugin Puncta Analyzer è stato sviluppato da Barry Walk ed è disponibile su richiesta in ImageJ 1.26. Aprire una delle immagini raccolte.

Utilizzare lo strumento di selezione circolare per selezionare una regione di circa un diametro cellulare in senso radiale attorno alla SOR di interesse. Con la regione di interesse selezionata, andare al menu plugin e selezionare l'analizzatore di punture nella finestra delle opzioni di analisi che appare; selezionare Canale Rosso Canale Verde. Eseguire prima la sottrazione dello sfondo e impostare il file dei risultati.

Fare clic su OK. Quindi definire la posizione in cui salvare i risultati. I risultati possono essere esportati in Excel per ulteriori analisi nella finestra che appare.

Successivamente, assicurarsi che sia selezionato un raggio della sfera rotolante di 50 e deselezionare l'opzione dello sfondo bianco. Questa modifica non è obbligatoria, ma è spesso preferita dagli utenti dell'applicazione. Per facilitare la visualizzazione, fare clic su ok.

Apparirà una nuova finestra accanto a una maschera corrispondente all'immagine del canale rosso. Regolare la soglia finché la maschera rossa corrisponde il più possibile a quante più singole perforazioni distinte, senza introdurre troppo rumore, quindi fare clic su fine.

Impostare la dimensione minima del punto su quattro pixel. Non modificare altro. Fare clic su OK.

Ripetere il passaggio precedente questa volta per il canale verde. Dopo aver ripetuto l'operazione con il canale verde, il plugin fornirà una quantificazione corrispondente ai puntini in ciascun canale separatamente e ai puntini co-localizzati tra i due canali. Il saggio di sinapsi mostrato qui può essere applicato a sezioni criocongelate del cervello e a qualsiasi altro tessuto del sistema nervoso, come il midollo spinale o la retina.

A condizione che sia disponibile una coppia adatta di marcatori pre- e post-sinaptici, iniziare prelevando il tessuto cerebrale da un topo che è stato sacrificato mediante esanguinazione e perfusione con PBS. Il giorno successivo, collocare l'intero cervello in paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius per tutta la notte.

Lavare il cervello tre volte con PBS. Proteggere criogenicamente il cervello ponendolo in saccarosio al 30% in PBS.

Il tessuto inizialmente galleggerà; mantenerlo a quattro gradi Celsius fino a quando non affonderà sul fondo. A questo stadio, la crioprotezione è completa. Successivamente, immergere il cervello in una soluzione in rapporto due a uno di saccarosio al 20% in OCT e PBS, orientandolo nella posizione desiderata per il sezionamento.

Ad esempio, sagittale o coronale. Successivamente, posizionare una superficie metallica piana sopra un contenitore di ghiaccio secco. Posizionare il cervello inclusato su di essa per congelarlo; una volta congelato, trasferire il cervello in un sacchetto per congelatore e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per un periodo fino a un anno prima della sezionatura.

Utilizzando un criostato, effettuare sezioni criogeniche del tessuto di 12-16 micron e montarle su vetrini. Successivamente, asciugare i vetrini ponendoli in un forno a 37 gradi Celsius. Quindi, risciacquarli tre volte con PBS per rimuovere l'OCT residuo.

Una penna al paraffina viene utilizzata per creare una barriera idrofoba attorno al vetrino e viene aggiunto un buffer di blocco al vetrino, impedendo così al liquido di fuoriuscire grazie al bordo di paraffina. Collocare i vetrini in siero normale di capra al 20% in PBS per un'ora a temperatura ambiente per il blocco; successivamente, posizionare le sezioni in anticorpi primari diluiti in PBS con tritone allo 0,3% e siero normale di capra al 10%.

Qui, l'anticorpo da coniglio anti-PSD 95 viene utilizzato per marcare i compartimenti postsinaptici glutammatergici e l'anticorpo da criceto anti-VGLUT2 viene utilizzato per marcare le terminazioni presinaptiche glutammatergiche. Posizionare le vetture a quattro gradi Celsius e incubare per 36-60 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere l'anticorpo primario lavando le vetture mediante immersione in PBS per tre volte, per 15 minuti ciascuna.

Dopo questo passaggio, assicurarsi di proteggere i vetrini dalla luce diretta. Applicare gli anticorpi secondari diluiti uno a 200 in PBS con 0,3% di tritone e 10% di siero di capra normale. In questo caso, capra anti cavia.

Alexa 488 e capra anti coniglio. Vengono utilizzati Alexa 594. Incubare per due ore a temperatura ambiente al buio.

Lavare i vetrini immergendoli quattro volte in PBS per 15 minuti ciascuno prima di montarli. Aggiungere piccole gocce di mezzo di montaggio Vector Shield con DAPI e coprire i vetrini con coprioggetti. Applicare lo smalto per unghie per impedire movimenti dei coprioggetti.

L'acquisizione delle immagini di sezioni di tessuto deve essere eseguita utilizzando un microscopio confocale con laser appropriati e un obiettivo ad immersione in olio da 63 volte per ciascuna immagine di sezione, con sezioni ottiche seriali a intervalli di 0,33 micron su una profondità totale di cinque micron, per un totale di 15 sezioni ottiche. Devono essere acquisite almeno tre sezioni per ogni animale e devono essere inclusi almeno tre animali per ciascuna condizione sperimentale. Generare proiezioni di intensità massima da gruppi di tre sezioni consecutive, ottenendo cinque proiezioni che rappresentano ciascuna un micron di profondità.

Questi vengono quantificati utilizzando ImageJ come descritto per i RGC, con una ROI modificata per determinare il numero di sinapsi formate in assenza di astrociti. L'immunocitochimica è stata eseguita su RGC dissociati trattati con mezzo di crescita basale, utilizzando anticorpi diretti contro bassoon, mostrato in rosso, e homer, mostrato in verde, come previsto. Si osservano pochissimi punti di colocalizzazione sinaptica per determinare l'effetto delle molecole secrete dagli astrociti sul numero di sinapsi formate in vitro; i RGC dissociati sono stati trattati ogni tre giorni con mezzo condizionato da astrociti murini per un totale di 12 giorni, seguiti dalla colorazione.

In questo neurone erano evidenti numerose sinapsi, ma presto appare in rosso. Homer è mostrato in verde in RDC dissociate trasfettate con Lee citoplasmatico che esprimeva TD-tomato e trattate solo con mezzo di crescita basale. Le sinapsi non sono visibili.

Il pomodoro TD appare in blu e la sinapsi appare in rosso. Vi è un segnale molto debole per il marcatore post-sinaptico homer mostrato in verde. Quando le stesse cellule vengono trattate cronicamente con mezzo condizionato da astrociti di ratto, si osservano molte sinapsi.

Il pomodoro TD è in blu, la sinapsina in rosso e l'homer in verde. Viene mostrato un RGC purificato che è stato trattato con mezzo condizionato da astrociti ed è stato colorato per i marcatori presinaptici in rosso e i marcatori postsinaptici homer in verde; le maschere di soglia generate utilizzando l'analizzatore di puncta corrispondono ai due canali presenti. Dopo aver identificato i punti di colocalizzazione, l'analizzatore di puncta produce una rappresentazione grafica di questi punti.

Un'analisi numerica viene fornita dall'analizzatore di puntini, che indica il numero di puntini discreti identificati in entrambi i canali e nei punti di colocalizzazione. I dati ottenuti dall'analisi di questo neurone illustrano la capacità delle molecole secrete dagli astrociti di promuovere la formazione di sinapsi, mostrata qui come un saggio di sinapsi in cui la colocalizzazione delle marcature immunohistochimiche pre- e post-sinaptiche è stata quantificata per dimostrare il potenziamento della formazione sinaptica indotta dagli astrociti mediante sovraespressione del recettore neuronale per la molecola sinaptogenica secreta dagli astrociti, thrombospondin. In questa figura è mostrato il numero medio di sinapsi per neurone trattato cronico con mezzo di crescita basale, gm, o con mezzo condizionato da astrociti.

A-C-M-A-C-M promuove in misura maggiore la formazione delle sinapsi nelle cellule gangliari della retina che sovraesprimono il recettore trombospondina rispetto alle cellule che sovraesprimono un vettore vuoto. Per quantificare la densità sinaptica nel collicolo superiore del topo, i compartimenti pre- e post-sinaptici sono stati marcati separatamente mediante marcatori immunohistochimici specifici per compartimento. Come mostrato qui, si è osservato un aumento del numero di sinapsi dal settimo giorno postnatale al giorno P14.

Questo illustra l'aumento del numero di sinapsi nel lobo superiore durante questa finestra temporale di sviluppo. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in circa due giorni per colture neuronali dissociate e in circa cinque giorni per sezioni cerebrali, a partire dal prelievo dall'animale seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'elettrofisiologia e la microscopia elettronica, vengono utilizzati per verificare che le variazioni nel numero di sinapsi riflettano rispettivamente modifiche nelle sinapsi funzionali e nelle sinapsi normali dal punto di vista ultrastrutturale.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare l'immunoeistochemia al proprio campione sperimentale per quantificare il numero di sinapsi. Questo protocollo descrive come utilizzare anticorpi specifici per compartimenti per etichettare in modo selettivo i compartimenti pre- e post-sinaptici. In questo contesto, definiamo le sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali ottenuti da ciascuno di questi marcatori.