Agar-Block Microcosmi per decomposizione controllata tessuti vegetali da Funghi aerobica

L'obiettivo generale di questa procedura è inoculare un fungo aerobico degradatore del legno in un microcosmo in piastra di Petri in cui l'umidità del legno e i substrati esogeni sono strettamente controllati. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto microcosmi con volumi esatti di mezzi noti. Successivamente, il legno da degradare e qualsiasi substrato solido esogeno vengono posizionati sopra una griglia di plastica sulla superficie dell'agar, evitando qualsiasi contatto tra i substrati.

Il microcosmo viene quindi inoculato e incubato con il fungo in esame. Al termine dell'incubazione, i blocchetti di legno vengono raccolti per determinare la perdita di massa e per preparare i tessuti da analizzare. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il grado di biodegradazione del legno e il ruolo delle fonti esogene di elementi mediante misurazioni della perdita di massa, osservazioni della morfologia del micelio e analisi elementari mirate, come la spettroscopia al plasma accoppiato induttivamente.

Ciao, mi chiamo Brooke Jacobson del laboratorio del Dott. Jonathan Schilling del Dipartimento di Ingegneria dei BioProdotti e dei Sistemi Biologici dell'Università del Minnesota. Oggi vi mostreremo un procedimento per utilizzare le piastre di Petri come microambienti per la decomposizione dei tessuti vegetali da parte di funghi aerobici. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi di decomposizione della lignocellulosa da parte dei funghi.

La lignocellulosa è il tessuto vegetale composto da lignina, cellulosa ed emicellulosa. Il tessuto che studiamo più frequentemente è il legno; errori legati agli aspetti meno tecnici della progettazione del blocco a coclea sono le cause più comuni di fallimento e le principali fonti di variabilità tra gli studi, rendendo utile la pubblicazione in forma video del nostro allestimento del blocco a coclea. Sulla base dell'esperienza, sappiamo che questa procedura produce risultati di alta qualità e con bassa variabilità.

Iniziamo. Per questi esperimenti, utilizzare piastre di Petri che siano un centimetro più profonde rispetto alle piastre di Petri tipiche, per aumentare lo spazio libero sopra il blocchetto di legno nel microcosmo.

Iniziare la preparazione del microcosmo preparando una quantità sufficiente di mezzo per 20 millilitri per piastra di Petri priva di calcio e ferro. Aggiungere 15 grammi di agar di tipo A in un matraccio tarato da 500 millilitri contenente circa 400 millilitri di acqua deionizzata integrata con integratori. Utilizzare soluzioni stock precedentemente preparate per aggiungere micronutrienti alla miscela.

Dopo aver aggiunto i nutrienti, portare il matraccio tarato alla linea dei 500 millilitri. Successivamente, trasferire il terreno in un matraccio da 1000 millilitri. Autoclavare a 121 gradi Celsius e 16 PSI per 20 minuti.

Attenzione a non superare un volume di 500 millilitri per flacone per evitare che l'agar si solidifichi prima che vengano somministrate le piastre di prova. Dopo l'autoclavatura, lasciare raffreddare il terreno fino a quando non è appena tiepido al tatto, per ridurre al minimo la condensa. La riduzione dell'umidità è fondamentale in questi esperimenti in quanto contenuto di umidità o mc.

Oltre l'80% provocherà anossia nei tessuti. Limitare il degrado da parte di funghi aerobici e aumentare la variabilità una volta. Raffreddare. Utilizzare un ausilio portatile per pipette e pipette sterili in polistirene da 10 millilitri in modo asettico.

Trasferire l'agar in una pila alta di piastre all'interno di una cappa a sicurezza biologica. Successivamente, tagliare abbondantemente delle griglie di plastica in modo che si adattino all'interno dei fondi delle piastre. Dopo aver tagliato e accuratamente lavato le griglie con sapone e acqua, prepararle per l'essiccazione e la sterilizzazione in autoclave per questa dimostrazione.

Il pino giallo del sud o SYP viene utilizzato poiché rappresenta una fonte importante di legname. Nelle abitazioni residenziali negli Stati Uniti, utilizzare legname non trattato e ricavare blocchi privi di nodi di 19 per 19 millimetri con un singolo taglio longitudinale lungo la vena del legno. Tagliare questa lunghezza in blocchi cubici di 19 millimetri.

Dividere i blocchi di 19 millimetri cubi a metà lungo la venatura utilizzando uno scalpello e un martello invece di una sega. Questo permette di ottenere un lato ruvido del blocco da posizionare rivolto verso il basso sulla rete di plastica nel microcosmo del blocco agricolo e un lato superiore liscio da etichettare. Etichettare il bordo liscio dei blocchi con una matita, tagliare un numero sufficiente di blocchi per soddisfare i trattamenti, nonché i controlli non inoculati che fungeranno sia da monitoraggio della contaminazione sia da campioni di dati di base condizionati in parallelo per materiale essiccato in forno, posizionare i campioni in contenitori di alluminio per siero di latte e in un forno a convezione a 100 gradi Celsius per 48 ore.

Trasferire i campioni dal forno a un essiccatore per raffreddarli una volta. Raffreddare. Pesare preventivamente i campioni per determinarne il peso secco iniziale. Infine, preparare i campioni, inclusi i supporti di plastica e il legno, per l'autoclavaggio avvolgendoli strettamente con carta di alluminio per ridurre al minimo l'assorbimento di umidità.

Questo non richiede che ogni campione venga avvolto singolarmente, ma che l'esposizione al vapore sia bassa e costante. Autoclavare i campioni etichettati a 121 gradi Celsius e 16 PSI per un'ora. All'interno di una cappa a sicurezza biologica sterile, assemblare AEs vuoti, una piastra sorgente per il substrato vegetale a rete dell'inoculo, materiali esogeni, strisce di paraformaldeide, pinze e strumenti di trasferimento.

Il passo successivo dell'inoculazione consiste nell'aggiungere i materiali all'agri, contenendo le piastre di Petri per minimizzare il rischio di contaminazione. Sterilizzare strumenti di trasferimento e pinzette con etanolo al 95% man mano che vengono utilizzati. Per prima cosa, aggiungere la rete di plastica alla piastra di Petri.

Quindi aggiungere qui il substrato di legno. Vengono aggiunti due blocchi di legno lungo la lunghezza della rete in modo che i dati possano essere abbinati tra i raccolti precoci e quelli tardivi. Questi blocchi vengono posizionati uno accanto all'altro con la venatura parallela e rivolti verso il punto di origine dell'inoculo fungino.

Successivamente, aggiungere i materiali esogeni qui. In questo esperimento si sta valutando il ruolo del gesso nella degradazione causata da un fungo filamentoso. Pertanto, il fungo deve incontrare questi dischi di gesso prima di raggiungere il legno.

Un disco di gesso viene aggiunto tra ogni blocco e punto di inoculo sulla parte superiore della rete. Prestare attenzione ad evitare il contatto tra i dischi nel legno, mantenendoli vicini tra loro. Per l'inoculo fungino, utilizzare un cavatappi numero quattro con diametro di sette millimetri per ottenere tappi da colture di due settimane cresciute in 20 millilitri di agar.

Questo aiuta a controllare il volume dell'inoculo. Per i controlli non inoculati, è preferibile aggiungere un tappo proveniente da una piastra sterile. Evitare il contatto tra l'inoculo e i substrati esogeni o il legno, ma posizionarli vicini tra loro.

Utilizzare un tassello di inoculo per ogni blocco. Sigillare le piastre con del param tagliato con un rasoio, mantenere le piastre in posizione orizzontale e avvolgere il param con un movimento uniforme e continuo. Infine, etichettare i coperchi delle piastre utilizzando un pennarello resistente all'alcol, indicando i numeri dei blocchi direttamente sopra i rispettivi substrati.

Disegnare anche cerchi sui dischi di gesso. Trasferire con attenzione le piastre in un'incubatrice biologica per evitare di agitare il contenuto e ridurre al minimo la condensa causata dalle fluttuazioni di temperatura. Le condizioni utilizzate sono 20 gradi Celsius e al buio; eseguire i prelievi in serie temporale in modo asettico, tranne per l'ultimo prelievo.

Al punto di raccolta della quinta settimana, rimuovere l'intero lotto di trattamento. Spruzzare ciascun fondo e coperchio con etanolo al 70% e utilizzare pinze flambé per rimuovere il materiale all'interno della cappa a sicurezza biologica. Scattare fotografie prima di distruggere le piastre agri, concentrandosi su qualsiasi forma morfologica F o melone.

Quindi rimuovere i blocchi da trattare. Rimuovere con attenzione qualsiasi eccesso di fanga, avendo cura di non perdere alcun materiale in decomposizione. Asciugare i blocchi in contenitori di alluminio e determinare la perdita di massa utilizzando i pesi freschi e secchi dei controlli per monitorare un'eccessiva capillarità.

I dati sulla perdita di massa aiutano a valutare l'andamento del decadimento e rappresentano informazioni importanti. Se le concentrazioni elementari devono essere calcolate in base al peso in grammi, i dati percentuali devono essere normalizzati. Per l'analisi statistica, etichettare e tracciare tutti i blocchi di colore marrone scuro, che sono chiaramente impregnati d'acqua.

Infine, smaltire le colture in sacchetti autoclavabili, conservando la rete di supporto in plastica e qualsiasi altro componente riciclabile da riutilizzare in futuri esperimenti. Nell'allestimento del microcosmo con blocchi di legno, i blocchi di legno di pino poggiano su una rete di plastica in modo da sollevarli al di sopra del contatto con l'agri. I Crains circolari crescono a diretto contatto con le superfici in gesso e penetrano all'interno dei blocchi di legno.

Questo micelio rappresenta un'importante connessione tra il legno e le fonti esogene di elementi nutritivi. Il controllo di queste fonti di materiali esogeni nell'agar o in materiali solidi costituisce un vantaggio chiave del design del blocco agricolo rispetto al design del blocco di suolo, con la perdita percentuale media di peso utilizzata come misura del grado di degrado del legno da parte di ser crain dopo cinque e quindici settimane. Qui viene mostrata l'incubazione con pino in microcosmi di blocco agricolo.

I trattamenti non sono stati effettuati. Cloruro di calcio 5 millimolare aggiunto all'agar più del 99% gesso puro o gesso integrato con il 1% di ferro per ogni raccolto; le barre con la stessa lettera non sono significativamente diverse. Considerando che le barre di errore rappresentano la deviazione standard, è stata osservata una perdita di peso superiore al 60% nei blocchi di pino marcescente del controllo, valore che soddisfa l'obiettivo stabilito dall'American Society for Testing and Materials di un decadimento superiore al 50%.

Il coefficiente medio di variazione nella decomposizione è stato 0,055 alla settimana 16. Oltre alla bassa variabilità, è stato osservato un effetto del trattamento. La decomposizione fungina è stata inibita con l'aggiunta di calcio, sia sotto forma di cloruro di calcio nell'agar che come gesso puro.

È interessante notare che le velocità di degrado aumentano con l'aggiunta di ferro al gesso. Questo suggerisce che è il ferro, e non il calcio, a essere fondamentale nell'osservazione delle cinque repliche alla quindicesima settimana di degrado. Mediante lo stesso fungo di marciume bruno, laminine circolari, il colore delle ife rivela mein.

Differenze nelle ife esterne tra i trattamenti; i blocchi sono stati rimossi e asciugati. A rivelare la mancanza di mein nel trattamento senza calcio. L'ingiallimento nei trattamenti con calcio puro e l'aspetto rugginoso nel trattamento arricchito con ferro.

Il controllo rappresenta blocchi non inoculati per il confronto. In modo interessante, gli effetti principali si annullano utilizzando un mezzo ricco di ferro. Nel complesso, ciò suggerisce che questo fungo utilizza il ferro, non il calcio.

In questi materiali, è stato illustrato come utilizzare un allestimento con blocchi a coclea per testare con successo la biodegradazione dei tessuti vegetali da parte di funghi filamentosi aerobi. Durante questa procedura, è importante ricordare di evitare che i substrati entrino in contatto tra loro, in particolare il tessuto vegetale e la coclea, per ridurre al minimo il contenuto di umidità proveniente dalla coclea e dalle piastrine, e verificare attentamente che il contenuto di ogni piastra non si sia spostato prima dell'incubazione. Tenendo presenti queste variabili, è possibile controllare l'ambiente di decomposizione molto meglio rispetto all'uso di un allestimento con blocchi di suolo.

È possibile generare dati con una potenza statistica sufficiente a rispondere alle domande della vostra ricerca. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.