Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre cristalli proteici per esperimenti di diffrazione a raggi X. Vengono illustrate tre diverse tecniche per la schermatura cristallina: metodi di cristallizzazione per diffusione di vapore, inclusi goccia sospesa e goccia appoggiata, nonché metodi di cristallizzazione in microbatch. Le cavità vengono riempite con precipitante.

Quindi, un'alta concentrazione del campione proteico purificato viene mescolata con l'agente precipitante. La goccia mescolata viene quindi sigillata in una pozzetta contenente la soluzione precipitante. La cristallizzazione in micro-batch inizia riempiendo la pozzetta con olio di paraffina.

La proteina viene quindi caricata nei pozzetti, seguita dalla soluzione precipitante. L'ultimo passaggio di tutti i metodi consiste nel lasciare equilibrare il sistema e nel monitorare la comparsa e la crescita dei cristalli all'interno delle gocce. In definitiva, è possibile ottenere cristalli mediante questa tecnica e determinare il pattern di diffrazione della proteina utilizzando una sorgente a raggi X con un rivelatore adeguato.

Ciao, sono Sal del laboratorio del Professor Yoga Motis del Dipartimento di biofisica molecolare e biochimica dell'Università di Yale. Oggi vi mostreremo un procedimento per la cristallizzazione di una proteina purificata. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le basi strutturali dell'infezione virale.

Iniziamo dunque a coltivare alcuni cristalli. Per identificare un metodo di cristallizzazione adatto a una macromolecola di interesse, si possono eseguire schermate iniziali utilizzando soluzioni di cristallizzazione disponibili in commercio, selezionate per sfruttare il metodo della matrice sparsa a fattoriali incompleti delle condizioni sperimentali. Queste condizioni vengono scelte in base a condizioni di cristallizzazione note e comunemente efficaci per le macromolecole.

Una volta nota la condizione di cristallizzazione, è possibile allestire una serie ristretta di provette variando la concentrazione del precipitante e il pH intorno al risultato iniziale. Di solito, le condizioni di cristallizzazione utilizzate per queste serie comprendono un agente precipitante e un tampone per regolare il pH; tutte le soluzioni stock devono essere filtrate attraverso un filtro da 0,22 micron per questa dimostrazione. Vengono utilizzate le condizioni di cristallizzazione precedentemente identificate per la lisozima del pollo, con cloruro di sodio come precipitante; iniziare la procedura preparando soluzioni di un millilitro con diverse concentrazioni di cloruro di sodio in acetato di sodio 0,1 M a diversi valori di pH.

Successivamente, scongelare il campione proteico conservato a meno 80 gradi Celsius e mantenerlo sul ghiaccio. Le concentrazioni proteiche tipiche rientrano nell'intervallo da cinque a 50 milligrammi per millilitro, con concentrazioni più elevate che di solito forniscono risultati migliori. In questo caso, viene utilizzata una soluzione di lisozima dell'uovo di gallina a 50 milligrammi per millilitro in acetato di sodio 0,02 molare a pH 4,9.

Centrifugare il campione per 15 minuti a 18.000 G e a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali proteine parzialmente aggregate o precipitati derivanti dal passaggio di scongelamento. Questi aggregati possono interferire con la crescita dei cristalli e favorire ulteriore aggregazione. Dopo la centrifugazione.

Determinare la concentrazione proteica a partire dal suo assorbimento a 280 nanometri utilizzando un fotometro a spettro UV. La concentrazione proteica può essere calcolata a partire dal valore di assorbanza e dal coefficiente di estinzione della proteina. Una volta che il campione proteico è pronto, riempire un vassoio di cristallizzazione a goccia sospesa in pozzetti da 24 con 500 microlitri di soluzione precipitante secondo la mappa del vassoio.

Crea un anello di grasso al silicone attorno al bordo di ogni pozzetto senza chiudere perfettamente l'anello, in modo che l'aria possa fuoriuscire durante l'inserimento del coperchio. Pulisci il vetrino coprioggetto con aria compressa in bomboletta o con un panno professionale per eliminare la polvere, il che facilita l'interpretazione delle gocce di cristallizzazione ed elimina contaminazioni. Il passaggio successivo consiste nel pipettare volumi uguali del campione proteico e della soluzione del serbatoio sul vetrino coprioggetto.

Tuttavia, nell'ambito del processo di ottimizzazione, possono essere provati diversi volumi di proteina e precipitante; l'uso di una quantità maggiore di proteina rispetto al precipitante determina una concentrazione netta della proteina nella goccia in equilibrio, il che può essere vantaggioso per campioni di proteina diluiti o per rallentare la nucleazione o la crescita dei cristalli. Per questa dimostrazione, due microlitri di lisozima a 50 milligrammi per millilitro in acetato di sodio 0,02 molare, pH 4, vengono caricati al centro del vetrino da copertura, seguiti da due microlitri di soluzione di cristallizzazione.

Quando si pipetta la soluzione proteica e quella del serbatoio sul vetrino coprioggetto, prestare la massima attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria, che spesso si verifica quando si espelle aria dalla pipetta. Mescolare delicatamente la goccia per aiutare a prevenire la precipitazione prematura della proteina dovuta a concentrazioni localmente elevate di precipitante; questo mescolamento è particolarmente importante per precipitanti viscosi come il polietilene glicole, utilizzando pinzette. Capovolgere delicatamente il vetrino coprioggetto e appoggiarlo sull'anello di grasso posto sopra il pozzetto, eseguendo questa operazione in modo direzionale in modo che l'aria possa fuoriuscire dal pozzetto.

In caso contrario, l'aria può sollevare il coprivetrino compromettendo la sigillatura della pozzetta. Procedere con la pozzetta successiva fino a completare la piastra. Una volta preparata la piastra, ispezionarla visivamente ed eliminare le particelle di polvere e altri contaminanti che potrebbero aumentare l'identificazione di falsi positivi di cristalli proteici.

Utilizzare un foglio di valutazione per documentare l'esperimento. Successivamente, posizionare il vassoio alla temperatura desiderata di incubazione, generalmente compresa tra quattro gradi Celsius e la temperatura ambiente. La temperatura più efficace è di 20 gradi Celsius.

È fondamentale maneggiare delicatamente il vassoio ed evitare vibrazioni o variazioni di temperatura durante il trasferimento o l'incubazione, poiché potrebbero impedire la crescita dei cristalli o comprometterne la qualità. Controllare il vassoio alla ricerca di cristalli il giorno successivo e poi ogni paio di giorni, maneggiando sempre i vassoi con attenzione. Registrare tutte le osservazioni e le morfologie delle gocce in un apposito foglio di valutazione specifico per il vassoio.

I cristalli impiegano in genere da due a cinque giorni per apparire, anche se a volte possono formarsi quasi immediatamente o addirittura dopo diversi mesi. Una volta identificate le condizioni di cristallizzazione e noto il tasso di crescita dei cristalli, è preferibile non disturbare i vassoi finché i cristalli non sono comparsi e non hanno raggiunto almeno la metà della dimensione finale. Mantenere i vassoi indisturbati può ridurre il numero di eventi di nucleazione cristallina, ottenendo così un numero minore di cristalli di dimensioni maggiori. Per la cristallizzazione in goccia seduta, seguire lo stesso procedimento della goccia sospesa, con la differenza che si utilizzerà un vassoio da 24 pozzetti per cristallizzazione in goccia seduta, in cui non sono necessarie coprioggetti.

Invece, il pozzetto contiene un ripiano su cui vengono miscelati la proteina e il precipitante. Pipettare due microlitri di soluzione di lisozima a 50 milligrammi per millilitro al centro del ripiano, evitando la formazione di bolle d'aria. Successivamente, aggiungere due microlitri di soluzione precipitante al campione dopo l'allestimento del vassoio. Sigillare i pozzetti con nastro ottico per la goccia sospesa.

Non sono necessarie coperture. Continuare l'incubazione e la valutazione dei cristalli come descritto per la goccia sospesa. Per eseguire una procedura in micro-batch.

Preparare la soluzione di cristallizzazione e la proteina come descritto per la procedura della goccia sospesa. Ottenere un nuovo vassoio per microbatch e utilizzare uno spray ad aria per evitare polvere e altre particelle di grandi dimensioni nel vassoio. Aggiungere olio di paraffina in ogni pozzetto fino a una profondità di tre millimetri.

Quindi rimuovere l'eccesso di olio. Successivamente, caricare un microlitro della soluzione proteica nel pozzetto pre-riempito, assicurandosi che la goccia affondi sul fondo del pozzetto. Poi aggiungere un microlitro della soluzione precipitante nel pozzetto.

Assicurarsi che la goccia affondi sul fondo della pozzetta e si fonda con la goccia proteica. Procedere alla pozzetta successiva fino a completare la piastra e continuare con l'incubazione e l'analisi dei cristalli come descritto qui. Risultati tipici della cristallizzazione proteica.

Vengono mostrati esperimenti. La precipitazione amorfa si verifica quando la proteina e/o il precipitante sono in alta concentrazione. Al contrario, le gocce non sature di solito rimangono limpide.

La separazione di fase può verificarsi se la proteina o il detergente si separano in una fase diversa quando vengono mescolati con determinati precipitanti ad alta concentrazione. In condizioni ottimali, i cristalli proteici dovrebbero formarsi in Arabidopsis csn. Sette cristalli proteici ottenuti in polietilene glicole 8.000 e acetato di magnesio appaiono con forma a bastoncino.

I cristalli mostrati sono cristalli di proteine lisosomiali ottenuti in una soluzione di cloruro di sodio e acetato di sodio ad una concentrazione di un molare, a pH 4,9. Questo filmato in time-lapse dimostra che i cristalli lisosomiali crescono formando prismi di grandi dimensioni entro poche ore dall'allestimento, utilizzando il metodo della goccia sospesa.

Abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento proteico quando si esegue questa procedura. È importante lavorare in un ambiente con controllo costante di temperatura e umidità, poiché un'elevata umidità aiuta a minimizzare l'evaporazione della goccia; cercare di adottare una tecnica che riduca al minimo l'esposizione della goccia all'aria aperta. Per questo motivo, è essenziale operare in un ambiente di lavoro ben organizzato.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.