Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

La elettrofisiologia è comunemente utilizzata per studiare l'attività di canali ionici voltaggio-dipendenti ricombinanti in cellule renali embrionali umane coltivate. Per ottenere registrazioni di successo, è necessario che le cellule esprimano i canali a livelli sufficienti sulla membrana cellulare per consentirne la rilevazione e che vengano seminate a una densità cellulare sufficientemente bassa da permettere l'isolamento di cellule singole. La realizzazione di registrazioni cellulari è spesso ostacolata dai lunghi periodi di incubazione a 28 gradi Celsius necessari per tale espressione, durante i quali si verifica tipicamente una perdita di adesione cellulare e di stabilità della membrana.

Qui viene dimostrato un metodo ottimizzato per la coltura cellulare e la trasfezione che aggira questi problemi. Le cellule vengono trasfettate a una densità moderata, quindi incubate a 28 gradi Celsius finché non si raggiunge un'espressione adeguata dei canali ionici. Le cellule trasfettate vengono quindi seminate su coprioggetti di vetro a bassa densità e incubate a 37 gradi Celsius per diverse ore per consentire l'adesione cellulare e la stabilizzazione della membrana.

Una volta piastrati in modo appropriato, le cellule vengono quindi identificate mediante l'espressione concomitante di EGFP e la tecnica del patch clamp su cellula intera. È possibile effettuare la registrazione oppure incubare nuovamente le cellule a 28 gradi Celsius. Per aumentare ulteriormente l'espressione superficiale dei canali, i risultati degli esperimenti di registrazione su cellule trasfettate con canali del calcio sensibili al voltaggio, come L CAV uno, L CAV due o L cav tre, indicano che i canali sono stati trasfettati ed espressi con successo dalle cellule.

Sebbene nel nostro laboratorio siano mostrati solo risultati rappresentativi per L CAV tre, abbiamo sviluppato un metodo per potenziare l'espressione di geni di canali ionici scarsamente espressi, al fine di effettuare registrazioni con tecnica del patch clamp in linee cellulari umane. Attualmente, l'approccio convenzionale prevede innanzitutto la suddivisione delle cellule su coprivetri e la trasfezione con plasmidi CDNA contenenti i geni dei canali ionici, seguita da un'incubazione di molti giorni a 28 gradi Celsius per ottenere un'espressione efficiente dei canali ionici prima della registrazione elettrofisiologica. Il nostro nuovo approccio riduce notevolmente il tempo di incubazione richiesto a 28 gradi Celsius prima della registrazione.

Ora, riducendo il tempo di incubazione a 28 gradi, osserviamo che le membrane cellulari sono molto più stabili e le cellule transfezionate aderiscono molto meglio ai coverslip. Ciò aumenta il numero di cellule registrabili e rende in modo significativo l'esperimento più efficiente. Prima della transfezione, suddividere un fiasco completamente confluenziale di cellule HEK 2 9 3 T, in un rapporto di uno a quattro, in un nuovo fiasco da 25 centimetri quadrati e collocare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.

Lasciare attaccare le cellule per tre o quattro ore; dopo quattro ore, esaminare le cellule mediante contrasto di interferenza differenziale per verificare l'attaccamento. Osservare che le cellule non appaiono più rotonde e si stanno appiattendo. Sono visibili estensioni o pseudopodi.

Le cellule meno confluenti avrebbero lo stesso aspetto ma sarebbero più distanziate tra loro. Una volta che le cellule si sono attaccate, combinare i reagenti necessari per eseguire una trasfezione standard con fosfato di calcio. Preparare un totale di 12 microgrammi di DNA in 600 microlitri di soluzione di trasfezione per ogni fiala.

Qui, i cDNA di vari canali ionici vengono clonati nel plasmide P-I-R-E-S contenente due copie di EGFP. La trasfezione di questo vettore di espressione in una linea cellulare di mammifero determina la produzione della proteina verde fluorescente migliorata a partire dallo stesso mRNA del frammento clonato, mediante traduzione avviata da un sito di ingresso interno dei ribosomi localizzato appena a valle della sequenza codificante per il canale ionico e a monte della sequenza codificante per EGFP. Questo approccio consente di identificare le cellule positivamente trasfettate senza interferenze potenziali sulla funzione proteica che potrebbero derivare dalla fusione diretta della proteina EGFP alla proteina di interesse.

Aggiungere goccia a goccia la soluzione di transfezione sulle cellule, quindi agitare delicatamente il flacone e collocarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tutta la notte fino al giorno successivo. Verificare l'efficienza di transfezione osservando le cellule al microscopio a fluorescenza. Le cellule positivamente transfezionate dovrebbero apparire verdi in tutta l'estensione cellulare.

Dopo aver verificato la trasfezione, pipettare con attenzione quattro-cinque millilitri di mezzo caldo nel flacone capovolto. Lavare le cellule capovolgendo lentamente il flacone in modo che la superficie cellulare sia rivolta verso il basso e agitando dolcemente il flacone in modo che la soluzione di lavaggio scorra delicatamente su di esse. Rimuovere il mezzo e ripetere questo lavaggio.

Ripetere il passaggio altre due volte. Quindi aggiungere sei millilitri di mezzo al flacone e incubare a 37 gradi Celsius per due ore. L'espressione dei canali ionici negli invertebrati presenta alcune difficoltà.

Innanzitutto, spesso sono di grandi dimensioni e potrebbero quindi richiedere molto tempo per essere tradotti nel reticolo endoplasmatico. Inoltre, potrebbero non essere indirizzati in modo efficiente alla membrana cellulare in una linea cellulare di mammifero. Infine, poiché specie diverse presentano diverse frequenze di utilizzo dei codoni, i cDNA eterologhi potrebbero contenere alte frequenze di codoni poco comuni nelle cellule di mammifero, come nelle cellule HEK 2 9 3 T, per superare alcune di queste difficoltà.

Dopo l'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius, lavare il transfect e trasferire i flaconi in un incubatore a 28 gradi Celsius per due-sei giorni per prolungare il periodo di espressione. Il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente per ogni tipo di canale ionico da esprimere. Poiché un'incubazione prolungata a 28 gradi Celsius provoca il distacco cellulare e una scarsa stabilità della membrana.

È necessaria un'ulteriore preparazione delle cellule prima di eseguire studi elettrofisiologici. In primo luogo, rimuovere il mezzo dalle cellule transfezionate mediante pipetta di aspirazione, aggiungendo un millilitro di soluzione di tripsina a 37 gradi Celsius in un’aliquota capovolta. Quindi riportare delicatamente l’aliquota nella posizione con la superficie cellulare rivolta verso il basso, in modo che la tripsina scorra dolcemente sulle cellule.

Rovesciare nuovamente il matraccio e rimuovere la tripsina. Quindi aggiungere 250 microlitri di tripsina calda direttamente sulle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti, fino al distacco delle cellule. Nel frattempo, posizionare da tre a otto coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina in una piastra di coltura da 60 millimetri e aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura caldo.

Una volta che le cellule si sono staccate, sospendetele in quattro millilitri di mezzo caldo pipettando su e giù circa sei volte; successivamente, utilizzando la punta della micropipetta, premete delicatamente sui coverslip per assicurarvi che siano sul fondo della piastra. Quindi aggiungete da 250 a 500 microlitri di cellule sospese. Incubate le cellule a 37 gradi Celsius per tre ore per permettere loro di aderire ai coverslip.

Lasciare le cellule a 37 gradi per troppo tempo provocherà la divisione cellulare e la diluizione dei plasmidi trasfettati. Le cellule trasfettate devono essere seminate a una densità sufficientemente bassa in modo da essere isolate le une dalle altre, come mostrato qui. Questo agevolerà la registrazione elettrofisiologica.

Per le cellule che richiedono subunità accessorie, è spesso necessario trasferire le cellule a 28 gradi Celsius e incubarle per altri tre o quattro giorni prima della registrazione elettrofisiologica. La registrazione viene effettuata su cellule che non richiedono subunità accessorie. La registrazione può essere eseguita immediatamente dopo questa incubazione.

L'apparato di elettrofisiologia utilizzato comprende un amplificatore, manipolatori motorizzati per pipette doppie, un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza e sistemi di perfusione. L'equipaggiamento è stato montato su un tavolo a isolamento dalle vibrazioni e da campi elettrici parassiti. I disturbi elettrici sono ridotti mediante una gabbia di Faraday di tipo due alta 40 pollici. I sistemi di controllo elettronici includono un PC dotato di una scheda digitale 1440, un'interfaccia convertitore analogico-digitale e il software P clamp 10.1.

L'amplificatore del monitor del computer, il manipolatore motorizzato e un sistema di controllo della perfusione con valvola sono tutti montati all'esterno della gabbia di Faraday. Su un telaio elettrico metallico indipendente da 19 pollici, tutti gli apparecchi elettrici sono collegati a massa a un distributore di rame e collegati a un trasformatore di isolamento di qualità medica, che fornisce isolamento di rete, un collegamento a massa costante e protezione contro le sovratensioni. Per prepararsi agli esperimenti, montare micropipette con estremità arrotondate al fuoco e con una resistenza compresa tra due e cinque megaohm sul supporto per micropipette presente sullo stadio testa.

Le pipette per il patch vengono riempite con soluzione interna, quindi agitate leggermente per rimuovere le bolle d'aria e infine montate sul supporto. Successivamente, utilizzando pinzette, trasferire un cover slip con cellule coltivate in una piastra di Petri di plastica da 35 millimetri contenente tre millilitri di soluzione esterna di registrazione a temperatura ambiente. Il volume della soluzione di registrazione deve essere misurato con precisione quando si eseguono esperimenti farmacologici, durante i quali quantità note di farmaco vengono aggiunte alla piastra mediante micropipetta; posizionare quindi la piastra sul palchetto del microscopio.

Quindi riempire la mezza cella del porta-microelettrodo con cloruro di cesio 3 M. Inserire quindi l'elettrodo di riferimento nella mezza cella e posizionare l'elettrodo di terra nel bagno utilizzando il micromanipolatore, abbassando la pipetta per il patch nel soluzione del bagno. Visualizzare le cellule in modalità fluorescenza e centrare una singola cellula aderente verde positivamente trasfettata al centro del campo visivo.

In modalità bath, avvicinare la pipetta per il patch a stretto contatto con la cellula. Azzerare il tracciato dell'onda quadra osservato sullo schermo del computer. Regolare la posizione della pipetta per il patch in modo che tocchi appena la cellula e il tracciato di corrente quadrata sullo schermo inizi a fluttuare.

Applicare un'aspirazione delicata con una siringa collegata fino a formare un sigillo gigaohm. Una volta raggiunto il sigillo gigaohm, passare al programma in modalità patch. Applicare un breve impulso di aspirazione con la siringa per rompere la membrana cellulare.

Quindi passare alla modalità cella e utilizzare i parametri per registrazione in whole cell sull'amplificatore. Per compensare il transitorio capacitivo, è necessario equilibrare la membrana in modo che la soluzione intracellulare di registrazione si diffonda nella cella sotto patch. Inserire qui i protocolli di clampaggio del voltaggio predisposti per questo esperimento.

Lo sperimentatore ha progettato un protocollo per misurare le correnti ioniche attraverso canali ionici attivati dal voltaggio, che si verificano quando il potenziale attraverso la membrana cellulare viene modulato. In questo caso, stiamo analizzando un protocollo IV che specifica che il software deve mantenere la cellula a meno 110 millivolt e poi passare a meno 70 millivolt per 250 millisecondi. Successivamente, ritorna al potenziale di mantenimento di meno 110 millivolt ogni volta che il passo aumenta di 10 millivolt, in modo che i passi siano a meno 70 millivolt, meno 60 millivolt, e così via, fino all'ultimo passo che raggiunge più 20 millivolt.

Filtrare le correnti registrate a 10 chilohertz utilizzando un filtro passa-basso di Bessel sull'amplificatore e digitalizzare a una frequenza di campionamento di due chilohertz utilizzando il software Clamp X 10.1. Utilizzare solo registrazioni con una perdita minima inferiore al 10%. Per l'analisi, le cellule HEK 293T sono state coltivate e trasfettate con canali del calcio L Cav. Tre canali ionici del calcio come mostrato qui. La trasfezione riuscita di cDNA eterologhi di canali ionici è stata indicata dalla fluorescenza generata dal vettore P-I-R-E-S due eeg FP.

Qui mostriamo un'espressione riuscita di un canale del calcio voltaggio-dipendente di tipo cav tre di invertebrato. Quando le cellule non vengono trasfettate, non è possibile elicitare correnti del calcio. Al contrario, le cellule trasfettate generano correnti elevate quando vengono applicati protocolli di voltage clamp in configurazione whole cell.

Gli sperimentatori possono utilizzare diverse condizioni elettrofisiologiche e regimi di analisi dei dati in base alle proprie esigenze. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di usare il proprio giudizio riguardo ai tempi degli esperimenti. Poiché diversi canali vengono espressi con efficienze differenti sulla membrana cellulare, spetta a voi determinare la strategia ottimale da adottare per aumentare la vitalità delle cellule e massimizzare l'espressione superficiale dei canali di interesse.

Dopo aver guardato questo video, speriamo che tu abbia acquisito una buona comprensione di come coltivare e mantenere una linea cellulare umana, nonché di come trasfettare cDNA di canali ionici eterologhi e cDNA di subunità in queste cellule. Per la registrazione elettrofisiologica.