Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per coltivare una varietà di lino inducibile in condizioni che determinano una variazione genomica ereditabile. Inoltre, vengono monitorati i cambiamenti genomici e viene osservata la crescita delle piante indotte nelle generazioni successive in diversi ambienti. Per raggiungere questo scopo, il lino viene coltivato in una serie di condizioni induttive.

Il tessuto fogliare e del fusto di Maris viene quindi raccolto in diversi momenti durante la crescita delle piante in vari ambienti. Successivamente, il DNA e l'RNA vengono isolati dai campioni di tessuto. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire la PCR utilizzando i campioni di DNA e la Q-R-T-P-C-R utilizzando l'RNA isolato, al fine di identificare le variazioni genomiche e le alterazioni nell'espressione genica risultanti dalla crescita in diverse condizioni ambientali.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la risposta genomica alle condizioni di crescita con la comparsa dell'elemento di inserzione LIS-1 in un punto specifico del genoma e le differenze di espressione associate alla presenza di tale elemento, come visualizzato mediante PCR e RT-PCR eseguite con acidi nucleici isolati dai tessuti delle piante trattate. Ciao, sono Chris Cull del Dipartimento di Biologia della Case Western Reserve University. Sono Cory Johnson del Cull Lab.

E io sono Tiffany Moss, anch'io del laboratorio Cull. E io sono Marshall Lucas, uno studente universitario nel programma estivo di ricerca per studenti universitari presso il laboratorio Cull.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le modifiche nel genoma e nell'espressione genica risultanti da variazioni nell'ambiente di crescita. Cominciamo dunque. Per coltivare la lino in condizioni induttive, iniziare riempiendo vasi da cinque pollici con terriccio e compattandolo.

Piantare successivamente tre semi di lino per vaso, ad una profondità di un quarto di pollice. Coprire quindi i semi con terriccio per le condizioni di controllo non induttive. Innaffiare le piante con 100 millilitri di soluzione di Miracle Grow diluita a un decimo della concentrazione.

Trattare le piante in condizioni di alta disponibilità di nutrienti con 100 millilitri di soluzione nutritiva completa. Miracle grow. Applicare infine.

Utilizzare solo acqua del rubinetto per le piante a basso contenuto nutritivo. Coltivare le piante alla luce naturale durante l'estate, mentre crescono. Irrigare tutte le piante mediante un sistema di nebulizzazione automatico due volte al giorno per cinque minuti.

Applicare le condizioni di crescita alle piante una volta alla settimana. Raccogliere le foglie insieme ai fusticini a intervalli settimanali. Per l'estrazione del DNA vengono raccolte sei foglie, mentre per l'estrazione dell'RNA sono necessari tre fusticini; dopo il campionamento, collocare il materiale vegetale in una provetta criogenica, congelarlo rapidamente in azoto liquido e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione.

I tre genotipi crescono a velocità relative diverse a seconda delle condizioni. In condizioni di controllo, la varietà di lino inbred storm oppure la linea PL cresce meglio. Diversi ceppi sono stati ottenuti da questo genitore, con una varietà grande o L più vigorosa rispetto alla varietà piccola o S.

Tuttavia, in condizioni di bassi nutrienti, S cresce meglio di L o di pl. In condizioni di alti nutrienti, L cresce meglio di pl, che a sua volta cresce solo leggermente meglio di S. Un confronto tra ciascuna delle linee coltivate in tre condizioni diverse rivela che PL cresce meglio nelle condizioni di controllo. L cresce meglio in condizioni di alti nutrienti, mentre S cresce in modo simile sia in condizioni di alti nutrienti che in condizioni di controllo.

Questi dati mostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita nei tre ambienti. Mentre PL e L crescono meglio in ambienti specifici, S cresce in modo simile in tutte e tre le condizioni. S non è in grado di sfruttare condizioni nutrizionali migliorate, ma è più efficiente nella crescita in condizioni di nutrienti molto basse.

Per l'estrazione del DNA, aggiungere il buffer AP del kit Qiagen DNEZ Plant DNA Prep a sei foglie con sabbia sterile in un tubo microcentrifuga e macinare il tessuto con una pestella micropestle fino a quando non sono visibili grumi. Continuare l'estrazione seguendo le istruzioni del kit. Per iniziare l'estrazione dell'RNA, trasferire tre fusti di maris e alcune foglie circostanti da una provetta criogenica a un tubo microcentrifuga. Aggiungere sabbia sterile al tubo e macinare il tessuto usando una micropestle fino a ottenere una polvere fine.

Vortexare il campione per 15 secondi per favorire la lisi, quindi centrifugare per un minuto a 13.000 giri/min per raccogliere la sabbia e eventuali detriti. Aggiungere il SNAT alla colonna di centrifugazione e proseguire con la preparazione dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Una volta estratto l'RNA dal tessuto, trasferire 10 XDNA buffer in un volume pari a un decimo del volume del campione di RNA nella reazione.

E a 30 unità di D Ns, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, seguiti da 70 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando il kit Applied Biosystems da RNA a CD NA. Secondo le istruzioni del produttore e di S, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Infine, eseguire cinque microlitri del cDNA su un gel AROS al 1,5% per determinare il rendimento. Una volta che il cDNA di lino è stato preparato, viene utilizzato per la QPCR. Eseguire la QPCR utilizzando un sistema A BI Step one.

Eseguire tutti i saggi in triplice replicato per ogni run e utilizzare il gene di controllo Actin come controllo del numero di copie per preparare le reazioni per la QPCR. Aggiungere un microlitro della coppia di primer appropriata a ogni tubo. Diluire il DNA alla concentrazione appropriata e aggiungere nove microlitri a ogni tubo.

Infine, aggiungere 10 microlitri del master mix PCR con cybergreen 2x in ogni provetta. Successivamente, impostare il programma di amplificazione seguendo l'amplificazione. Calcolare i livelli di espressione relativi in base al numero di cicli per il valore soglia, determinato dai parametri predefiniti nel software StepOne e confermato mediante l'analisi delle curve di amplificazione.

L'amplificazione mediante PCR del DNA, isolato da foglie in posizioni diverse lungo il fusto, dimostra la comparsa di un frammento di DNA di 5,7 chilobasi in singola copia, denominato sequenza di inserzione della linea, o LIS uno, quando le piante vengono coltivate in condizioni induttive. LIS uno compare quando la PL è coltivata in condizioni induttive di basso contenuto nutritivo e alla fine diventa omozigote. Qui, campioni fogliari da uno a sei sono stati isolati a intervalli settimanali, con il campione uno prelevato in epoca più precoce dopo la semina; successivamente il DNA è stato estratto dai campioni.

L'amplificazione mediante PCR rivela la presenza di entrambi i capi di LAS uno in tutti i campioni tranne il primo. Questo corrisponde alla scomparsa del sito inserito non integrato e alla mancanza di evidenza dello stesso alla QPCR della quinta foglia. I risultati mostrano che la presenza di LAS uno o di altre modifiche genomiche associate all'induzione influisce sull'espressione dei geni nelle immediate vicinanze di un S uno.

I sei geni mostrati qui sono tutti espressi in modo differenziale nel PL e nell'S; quattro dei geni presentano un'espressione maggiore nel pl, che non possiede LIS uno. Al contrario, due geni mostrano un'espressione maggiore nell'S, che possiede LIS uno. Vi abbiamo appena mostrato come coltivare linee di lino inducibili. Pertanto, il genoma cambia in risposta all'ambiente di crescita e alle caratteristiche di crescita delle generazioni successive.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le condizioni di crescita devono essere replicate per ottenere un'induzione riproducibile dei cambiamenti. Questo è tutto. So che molti di voi sono scettici riguardo a questo fenomeno, ma ora potete riprodurre le osservazioni autonomamente.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.