Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali
8 dicembre 2010
Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.
Prima parte, Introduzione. Salve, mi chiamo Rafael. Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del Professor Stevens Hans presso l'Università Federale di Rio de Janeiro in Brasile.
Ciao, mi chiamo Ismail. Sono un assistente di ricerca e anche professore. In questo video, mostreremo come preparare sezioni chiare di corpi Android.
Iniziamo. Parte due, materiali e attrezzature. Per questa procedura, avremo bisogno di un mezzo di inclusione per campioni congelati.
Soluzione al 4% di paraformaldeide per la fissazione delle cellule, soluzioni di saccarosio per la protezione criogenica. Un ago con la punta leggermente ricurva, un microscopio stereoscopico per una migliore visualizzazione dell'EBS e un agitatore. Parte tre.
Qui i corpi embrionali umani vengono coltivati in piastre da coltura non aderenti. Utilizzando una pipetta, raggruppiamo tutti i corpi embrionali il più vicino possibile al fine di trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri. I corpi embrionali vengono raccolti con attenzione e trasferiti nel tubo.
È importante raccogliere tutti gli EBS poiché non è presente una grande quantità di materiale. Dopo aver decantato gli EBS, il mezzo di coltura viene accuratamente eliminato. Dovreste essere in grado di vedere il pellet sul fondo del tubo. Ora possiamo procedere con la procedura di fissazione.
Le EBS verranno fissate in una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS o soluzione salina tampone fosfato. È importante risospendere il pellet con la soluzione di PFA. Le EBS vengono quindi fissate nella soluzione di fissazione per 30 minuti.
Dopo la fissazione, la soluzione di PFA viene rimossa con attenzione. Si provvede a evitare il rimescolamento degli EBS e a sostituire la soluzione con una soluzione al 10% di saccarosio in PBS per avviare la crioprotezione degli EBS; il materiale viene mantenuto in questa soluzione per 30 minuti. Successivamente, si rimuove con cura la soluzione al 10% di saccarosio e si risospendono gli EBS in una soluzione al 20% di saccarosio.
Anche in questo caso, gli EBS vengono mantenuti per 30 minuti in questa soluzione. Infine, la soluzione di saccarosio al 20% viene rimossa e sostituita con una soluzione di saccarosio al 30% in PBS, dove vengono lasciati per altri 30 minuti. A questo punto, possiamo procedere con l'orientamento e il bloccaggio degli EBS.
Nel nostro laboratorio, utilizziamo capsule vuote come stampi. Per il bloccaggio degli EBS, è importante rivestire le pareti interne della punta con una soluzione di saccarosio prima di raccogliere gli EBS. Ora possiamo raccogliere con cura gli EBS e attendere finché non si depositano sul fondo della punta.
Successivamente, gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Questa deve essere la posizione finale degli EBS all'interno del blocco. Con l'aiuto di un microscopio stereoscopico e di una punta fine, raccogliamo e rimuoviamo la maggior quantità possibile di soluzione di saccarosio.
Aver cura di non raccogliere mai gli ebs. Utilizzando un ago con la punta leggermente ricurva, tutti gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Infine, la soluzione di saccarosio rimanente viene raccolta con pezzi di carta da filtro.
La posizione specifica dell'EBS all'interno del blocco è molto importante per ottenere sezioni di buona qualità. Ecco un esempio di posizionamento inadeguato dell'EB all'interno della capsula. Dopo il posizionamento dell'EBS e la rimozione della soluzione di saccarosio, la capsula viene riempita con OCT a partire dai bordi, avendo sempre cura di evitare che l'EBS rimanga sospeso nel Resus.
Le bolle rimanenti vengono rimosse utilizzando una pipetta, e i gusci vengono agitati per 15 minuti. Dopo l'agitazione, il blocco di OCT viene congelato nel ghiaccio secco.
A questo punto, è possibile conservare il blocco avvolto nella carta d'alluminio a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi oppure procedere al passaggio successivo con il criostato, parte quattro, taglio. Per ottenere le sezioni criogeniche, saranno necessarie una lama monouso o permanente, OCT e vetrini in vetro trattati con poli-L-lisina. Il blocco in OCT viene prelevato dal congelatore e mantenuto all'interno del criostato fino al raggiungimento di meno 20 gradi Celsius.
Il blocco viene quindi posizionato sul supporto e allineato parallelamente al bordo della lama. I campioni di EB sono molto più piccoli della maggior parte degli altri campioni di tessuto, quindi è molto importante assicurarsi che l'intera superficie del blocco tocchi contemporaneamente la lama, riducendo al minimo la perdita di materiale. Dopo essere stato posizionato, il blocco viene tagliato in fette di 10 micrometri, che vengono raccolte direttamente sui vetrini.
Le preparazioni possono essere conservate, preferibilmente a meno 70 gradi Celsius, oppure possono essere utilizzate lo stesso giorno. Il materiale può essere colorato per immunohistochimica o immunofluorescenza. Conclusione. Il metodo descritto in questo articolo fornisce un protocollo ragionevolmente economico e di facile esecuzione per ottenere sezioni sottili al criostato di corpi embrionali sviluppati da entrambe le linee cellulari staminali umane H nine o di topo US P one.
Le sezioni crio possono essere utilizzate in una vasta gamma di procedure al fine di analizzare l'espressione proteica o la morfologia degli EB.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo articolo viene illustrato il processo per ottenere criosezioni di alta qualità di corpi embrionoidi (EB) derivati da cellule staminali pluripotenti coltivate in sospensione. Queste criosezioni sono essenziali per lo studio degli aspetti cellulari e molecolari dell'embriogenesi, mantenendo al contempo l'organizzazione degli EB.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Embriogenesi
- Differenziamento cellulare
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- I corpi embrionoidi sono aggregati che imitano lo sviluppo embrionale precoce.
- Lo studio degli EB aiuta a comprendere i meccanismi dell'embriogenesi.
- Sezioni criostatiche di alta qualità sono fondamentali per un'analisi dettagliata.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per la preparazione di sezioni crioconservate di corpi embrionici (EBs).
- Facilitare lo studio dei processi cellulari e molecolari durante la differenziazione.
- Preservare l'organizzazione strutturale degli EBs nell'analisi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione.
- Induzione della differenziazione in corpi embrionici.
- Tecniche di criosezionamento per ottenere campioni di alta qualità.
- Analisi delle caratteristiche cellulari e molecolari dei corpi embrionici.
Risultati principali
- Preparazione riuscita di sezioni crioconservate da corpi embrionali (EB).
- Preservazione dell'organizzazione degli EB nelle sezioni crioconservate.
- Migliorata capacità di studiare l'embriogenesi a livello cellulare.
- Il metodo dimostrato può essere applicato a diversi contesti di ricerca.
Conclusioni
- Il metodo consente un'analisi dettagliata degli EB.
- Sezioni criostatiche di alta qualità sono preziose per studi embriologici.
- Questo approccio può migliorare la comprensione della differenziazione delle cellule staminali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La criosezione di alta qualità di corpi embrionoidi (EB) derivati da cellule staminali pluripotenti consente un'analisi spaziale precisa dei marcatori di differenziamento e dell'organizzazione tissutale, sostenendo la scoperta precoce e la validazione degli obiettivi nella medicina rigenerativa e nella biologia dello sviluppo. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nei modelli basati su cellule staminali e orienta decisioni adeguate al rischio in punti critici della pipeline di scoperta. Sezioni criostatiche di EB affidabili facilitano l'integrazione di dati trasversali ai fini dell'avanzamento del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'espressione dei marcatori di pluripotenza e specifici della linea cellulare all'interno di strutture di corpi embrionali tridimensionali.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici chiarificando i percorsi di differenziazione e l'eterogeneità cellulare.
- Fornisce un contesto spaziale per la validazione funzionale di bersagli in sistemi derivati da cellule staminali.
Sviluppo di screening e saggi
- Semplifica la preparazione di sezioni crioconservate di EB standardizzate per saggi riproducibili di immunofluorescenza e ibridazione in situ.
- Consente una valutazione quantitativa della distribuzione di proteine e RNA attraverso le sezioni di EB.
- Permette la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per lo screening di composti in modelli di cellule staminali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la differenziazione in vitro ai processi di sviluppo in vivo per una modellizzazione pertinente alle malattie.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica preservando l'architettura degli embriocorpi e la localizzazione dei marcatori.
- Fornisce informazioni meccanicistiche che guidano le strategie traslazionali per biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di criosezionamento si integra nel percorso di scoperta, dalle prime fasi dello studio sulla differenziazione delle cellule staminali fino allo sviluppo di saggi e alla validazione di modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla pluripotenza e sul destino differenziativo all'interno dei corpi embrionici (EB).
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per l'espressione dei marcatori e l'organizzazione dei tessuti.
- Analisi: Permette misurazioni con risoluzione spaziale per l'analisi comparativa delle condizioni di differenziamento.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a rilevanze nello sviluppo in vivo, quando supportati dai profili di espressione dei marcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato per l'analisi degli EB applicabile a diverse linee di cellule staminali e protocolli di differenziamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella differenziazione delle cellule staminali e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza la sezionatura degli EB per analisi downstream riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati spaziali e molecolari robusti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sulla gestione del rischio dei programmi di scoperta basati su cellule staminali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella criosezione e nella manipolazione di aggregati cellulari tridimensionali delicati.
- Necessita dell'accesso a criostati, mezzi di inclusione e infrastrutture per l'analisi mediante imaging per analisi successive.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro delle procedure di preparazione e di sezione degli EB.
- Adattabile a diverse linee di cellule staminali pluripotenti e modelli di differenziamento, prestando attenzione alle dimensioni e alla morfologia degli EB.
- Dipende da un'accurata orientazione e inclusione per garantire sezioni di alta qualità e interpretabili.
