Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Questo video illustra una procedura per analizzare la morfologia di dendriti e assoni, noti collettivamente come neuriti, mediante un programma semi-automatico al fine di osservare modifiche locali. In primo luogo, il software First Neuron J viene utilizzato per tracciare immagini TIFF a otto bit di neuroni al fine di identificare la posizione dei segmenti dei neuriti. Successivamente, il software Neuron Studio viene impiegato per definire informazioni strutturali sulla connettività tra i neuriti.

Infine, viene eseguito il programma MATLAB bonfire per estrarre dati morfologici dalle cellule, inclusa l'analisi dello shoal, nonché il numero di punti di diramazione dei neuriti e le estremità dei neuriti. I risultati mostrano cambiamenti locali nella morfologia dei neuriti in base all'esecuzione dell'analisi dello shoal su sottoregioni dell'albero neuritico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi dello shoal manuale, è che il programma è semi-automatico, il che aumenta notevolmente l'efficienza dell'analisi e consente di verificare i dati in modo da poterne controllare l'accuratezza.

La procedura sarà dimostrata da Hirsch AWA, studente universitario che lavora nel laboratorio di Firestein durante l'estate. Per utilizzare il programma Bonfire per analizzare le caratteristiche morfologiche dei neuriti, è necessario ottenere immagini in formato TIFF a 8 bit di singoli neuroni dopo aver scaricato il programma Bonfire. Le impostazioni del programma devono essere regolate in base alla risoluzione delle immagini che si desidera analizzare: nella sezione parametri di Bonfire del programma Bonfire, sostituire il valore attuale della variabile picks conversion con il valore della risoluzione delle proprie immagini.

Per consentire a bonfire di analizzare i dati, i file devono essere organizzati in una struttura specifica, che comprende una cartella principale, una cartella bonfire contenente i file MATLAB M di bonfire, sottocartelle contenenti ciascuna delle diverse condizioni e i file delle immagini cellulari all'interno delle cartelle delle diverse condizioni; iniziare preparando l'immagine per la tracciatura. Per questo esperimento, verranno tracciati solo i dendriti al fine di analizzare le modifiche nella morfologia dendritica. Iniziare preparando l'immagine per la tracciatura.

Aprire l'immagine selezionando il pulsante di apertura sulla barra degli strumenti di NeuronJ e scegliere l'immagine che si desidera tracciare. Ridimensionare ora l'immagine selezionando il pulsante di massimizzazione per regolare luminosità e contrasto in modo da visualizzare tutti i neuriti; selezionare l'immagine sulla barra degli strumenti di NeuronJ, quindi scegliere regola luminosità e contrasto. Per iniziare il tracciamento, selezionare il pulsante aggiungi tracce sulla barra degli strumenti di NeuronJ e tracciare attorno al perimetro del corpo cellulare.

Quindi selezionare il pulsante "tracce etichetta" sulla barra degli strumenti di NeuronJ e scegliere N uno dal menu a discesa ID tracciamento; nella finestra degli attributi di NeuronJ selezionare il tipo zero sei e fare clic su OK. Per iniziare il tracciamento dei neuriti, selezionare il pulsante "aggiungi tracce" sulla barra degli strumenti di NeuronJ e aggiungere una traccia lungo ciascun ramo di neurite di interesse. È preferibile che i segmenti disegnati terminino a ogni punto di biforcazione, con ciascun ramo figlio che inizia in quel punto come nuova traccia.

Selezionare il pulsante salva tracciamenti sulla barra degli strumenti di Neuron J e salvare il tracciamento appena creato nella stessa cartella del file immagine originale. Successivamente, esportare i file di tracciamento e i file di identificazione dei tracciamenti da Neuron J. Selezionare il pulsante esporta tracciamento sulla barra degli strumenti di Neuron J. A questo punto, selezionare l'opzione file di testo separati da tabulazioni, un file per ciascun tracciamento, nella finestra di dialogo di esportazione di Neuron J e fare clic su OK, consentendo a Neuron J di scegliere i nomi dei file e la posizione di salvataggio.

Selezionare il pulsante "measure tracings" sulla barra degli strumenti di Neuron J, quindi selezionare l'opzione "display tracings measurements" nella finestra delle misurazioni di Neuron J e selezionare "run Select file" nella finestra dei tracciamenti di Neuron J; quindi scegliere "save as" e salvare il file. Il nome del file deve corrispondere esattamente al nome del file immagine originale, seguito da underscore e "info", e non deve contenere un'estensione di tre lettere. Verificare che il computer non aggiunga automaticamente l'estensione del file XLS.

Se così fosse, l'estensione del file deve essere eliminata manualmente. Innanzitutto, riorganizzare le cartelle utilizzando bonfire load aprendo matlab e facendo clic sul pulsante con i tre punti in alto a destra nella finestra dei comandi. Selezionare la cartella bonfire nella propria cartella principale nella finestra di ricerca delle cartelle, digitare bonfire load nella finestra dei comandi e premere invio.

Selezionare la cartella della condizione che si desidera analizzare nella finestra di navigazione delle cartelle e selezionare OK. Verrà riorganizzata la struttura delle cartelle creando sottocartelle per ogni singola cellula, contenenti tutti i dati relativi a ciascuna cellula. Per creare file con nome seguito da underscore e estensione swc, digitare bonfire_ NDF2sWC nella finestra dei comandi e premere invio.

Selezionare la stessa cartella di condizione che è stata appena riorganizzata con il caricamento di bonfire nella finestra di navigazione delle cartelle e selezionare Ok. Verrà creato un file WC in ogni cartella cellulare per la condizione scelta. Ogni cartella cellulare conterrà cinque file.

L'immagine TIF originale, il file NDF, le informazioni con underscore, il file identificatore delle tracce, un file TXT e un file swc. Prima di utilizzare Neuron Studio, si consiglia di prendere familiarità con le funzionalità e le scorciatoie del programma. È disponibile un eccellente manuale utente online e la conoscenza delle scorciatoie da tastiera consentirà di risparmiare molto tempo.

Per iniziare, aprire il programma Neuron Studio e selezionare File Apri sulla barra degli strumenti di Neuron Studio, quindi individuare l'immagine TIF del neurone che si desidera modificare e aprire. Selezionare Impostazioni di esecuzione e inserire uno in ciascuna delle tre caselle.

Nella finestra della dimensione del voxel, selezionare l'importazione del file s wc. Selezionare il file s WC appropriato corrispondente al file con cui si desidera lavorare. Il file immagine verrà ora sovrapposto all'immagine della traccia.

Il corpo cellulare deve essere sovrapposto da un cerchio rosso per collegare i neuriti. Utilizzare lo strumento per i neuriti per unire i nodi in modo che ogni punto di biforcazione, rappresentato da nodi gialli, possa generare soltanto due rami. Tutte le tracce devono essere continue con il soma.

Ora, per esportare i dati da Neuron Studio, selezionare file, salva neuriti e salva con il nome predefinito per verificare eventuali errori nei file swc digitando bonfire trace. Accedere alla finestra di comando e premere invio. Selezionare la cartella della condizione contenente i dati appena elaborati nella finestra di ricerca cartella e selezionare ok se sono presenti errori in una delle immagini della cartella.

Il programma genererà immagini che mostrano dove si trova l'errore per estrarre i dati morfologici dai file dot S WC. Digitare bonfire nella finestra del comando e premere invio. Selezionare la cartella della condizione che si desidera analizzare nella finestra di ricerca della cartella, quindi selezionare ok per ciascuno dei neuroni di interesse.

L'analisi bonfire genererà un grafico della morfologia neuronale insieme agli anelli periferici utilizzati nell'analisi. Inoltre, il comando bonfire produrrà il file MAT che contiene tutte le informazioni morfologiche ottenute dall'analisi. Per visualizzare i grafici preliminari dei dati, digitare bonfire results nella finestra dei comandi di MATLAB, selezionare la cartella della condizione da visualizzare nella finestra di ricerca della cartella e fare clic su Okay.

La finestra di selezione della cartella si chiuderà temporaneamente e si riaprirà, consentendo di selezionare ulteriori condizioni. Una volta selezionate le condizioni, scegliere Annulla per uscire dal processo di selezione. Il risultato di Bonfire mostrerà grafici riassuntivi, inclusi i dati delle cartelle di condizione selezionate, per esportare i dati morfologici in formato Excel; esportare in Bonfire di tipo Excel nella finestra dei comandi di MATLAB.

Selezionare la cartella della condizione contenente i dati che si desidera esportare nella finestra di navigazione delle cartelle e confermare. Bonfire Export creerà file Excel con i dati morfologici e li posizionerà nella cartella della condizione selezionata. Ora vi mostreremo un esempio dei dati generati dal programma Bonfire su un set di dati contenente due condizioni.

Queste sono immagini invertite di esempio relative a entrambe le condizioni. Da queste immagini si può osservare che la condizione uno contiene più dendriti rispetto alla condizione due. Questo fenomeno può essere osservato anche in una varietà di grafici generati dal programma bonfire.

Poiché il programma bonfire esegue l'analisi su sottoregioni delle dendriti, le dendriti aumentate nella condizione uno possono essere facilmente identificate; tracciando la curva dello shoal dell'intero albero dendritico si osserva che vi sono più dendriti distali rispetto al corpo cellulare nei neuroni della condizione uno. Tracciando il numero medio di punti di biforcazione e di punti terminali per cellula si evidenzia che la condizione uno presenta sia un numero maggiore di punti di biforcazione sia un numero maggiore di punti terminali rispetto alla condizione due. Il numero medio di processi per cellula è mostrato per dendriti primarie, secondarie, terziarie o di ordine superiore. Vi sono più dendriti terziarie e di ordine superiore nella condizione uno; tracciando il numero medio di processi per cellula per dendriti radice, intermedie e terminali si osserva che la condizione uno possiede più processi intermedi o terminali rispetto alla condizione due.

Qui sono mostrate le curve di analisi del branco specifiche per l'identità dei segmenti, in cui i segmenti sono raggruppati come primari, secondari o terziari e oltre. L'aumento dei dendriti terziari si verifica in posizione distale rispetto al corpo cellulare nei neuroni della condizione uno. Sono mostrate le curve di analisi del branco specifiche per l'identità dei segmenti, in cui i segmenti sono raggruppati come segmenti radice, segmenti intermedi o segmenti terminali.

L'aumento sia delle dendriti intermedie sia di quelle terminali nella condizione uno avviene in posizione distale rispetto al corpo cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi dello shoal utilizzando il programma bonfire per osservare i cambiamenti locali nella neuro-morfologia.