Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Gli alfavirali sono virus a RNA trasmessi dalle zanzare che infettano in modo persistente le cellule di zanzare suscettibili con minima citopatologia. Questo protocollo illustra l'utilità dei sistemi transducibili di alfavirali infettivi che esprimono marcatori fluorescenti per il rilevamento dell'infezione del vettore e della trasmissione del virus. In primo luogo, somministrare a zanzare femmine un pasto ematico contenente l'alfavirus di interesse, quindi determinare l'efficienza di infezione delle zanzare e selezionare solo le zanzare che esprimono il gene marcatore.

Successivamente, raccogliere la saliva dalle zanzare infette e dimostrare la trasmissibilità infettando cellule di zanzara coltivate con la saliva raccolta. Risultati ottenuti mediante microscopia epifluorescente. Visualizzare un rapporto di proteine come GFP e quindi tracciare l'infezione del vettore e la trasmissione del virus mediante zanzare dei generi *Aedes* o *Culex*.

I sistemi di espressione virale alfa o ATS possono essere utilizzati per valutare rapidamente l'espressione genica e le zanzare vettori, sia per studi su arbovirus che prima di effettuare manipolazioni più complesse sulle zanzare, come la trasgenesi. La dimostrazione di queste procedure sarà effettuata dalla dottoressa Irma Sanchez Vargas, dal dottor Eric Mossel e da Aaron Phillips del laboratorio del dottor Ken Olson. Per produrre un virus TS in cellule BHK-21, utilizzare un virus ricombinante symbis che esprime il reporter GFP dopo la trascrizione in vitro, quindi elettroporare l'RNA del sistema transducente virale alfa nelle cellule BHK-21.

Quindi recuperare e amplificare il virus prima dell'infezione. Prime le zanzare per un pasto ematico efficiente da un'alimentatore artificiale mediante la privazione di cibo. Rimuovere lo zucchero 24 ore e l'acqua 12 ore prima del pasto.

Mescolare sangue animale ottenuto commercialmente, defibrillato o citrato, con la sospensione virale derivata dalla coltura cellulare preparata per ottenere un'infezione efficiente dell'intestino medio delle zanzare. Formulare un titolo virale di 10 alla settima unità formanti placche per millilitro per il pasto ematico, al fine di stimolare le zanzare all'ingorgo. Aggiungere TP a una concentrazione finale di 0,02 molarità.

Posizionare una membrana intestinale porosa sull'apertura del beccuccio in vetro con giacca d'acqua. Successivamente, preparare i beccucci con acqua circolante a 37 gradi Celsius. Quindi pipettare il pasto nella camera e posizionare i beccucci in modo sicuro sul cartone.

Dopo aver nutrito le zanzare per 10-30 minuti, anestetizzarle con il freddo e selezionare gli esemplari sazi di sangue per consentire la replicazione e la disseminazione di un virus TS nelle zanzare scelte. Incubarle a 28 gradi Celsius e al 75% di umidità relativa per otto-dieci giorni. Per immobilizzare le zanzare.

Posizionare il cartone contenente la carta a quattro gradi Celsius per circa 15 minuti. Trasferire ora da cinque a dieci zanzare su un tavolo refrigerato adatto all'uso su un microscopio a fluorescenza. Esaminare e separare le zanzare in base alla presenza o assenza di fluorescenza.

Riportare le zanzare selezionate nel cartone di carta per l'uso desiderato. A questo punto, determinare l'efficienza di infezione utilizzando l'intensità della fluorescenza come indicatore. Infine, dissezionare tessuti come midgut, ghiandole SIV e corpi adiposi, e monitorarli per rilevare la fluorescenza.

Questi organi e tessuti possono essere dissecati in momenti precedenti, se desiderato. Deprivare le zanzare della fonte di zucchero per 24 ore prima del pasto. Preparare un capillare da 50 microlitri che sia stato riscaldato, tirato e tagliato, contenente da tre a cinque microlitri di Cargill.

Utilizzare olio di immersione di tipo B per evitare che le zanzare fuggano. Rimuovere loro zampe e ali. Inserire ora il rostro nel tubo.

Monitorare attentamente le goccioline di saliva che fuoriescono dalla proboscide nell'olio di immersione. Se necessario, applicare una goccia di pilocarpina al 1% sul torace della zanzara per aumentare la salivazione dopo 60-90 minuti, quindi rimuovere le zanzare e conservarle per future isolamenti virali. Per raccogliere la soluzione dal tubo capillare, espellere la miscela di saliva e olio in un tubo contenente 500 microlitri di PBS sterile con il 20% di FBS.

Filtrare l'inoculo attraverso un filtro siringa da 0,2 micron, quindi utilizzare questo inoculo per infettare cellule coltivate in cellule di zanzara. L'efficacia dell'infezione con il virus GFP DS MRE 16 cinque prime viene valutata mediante l'espressione di GFP. Nel tempo, queste cellule sono state infettate con il virus a una molteplicità di infezione di 0,01.

Un microscopio a fluorescenza episcopica consente una visione d'insieme della GFP nel morso infetto, così come nelle diverse parti del corpo, a 10 giorni dall'infezione. L'espressione selettiva della GFP negli organi è indicativa di un'infezione disseminata. L'intestino medio presenta solitamente focolai distinti di infezione nelle prime fasi dopo l'ingestione di un pasto ematico contenente il virus, che successivamente si diffonde in tutta la regione posteriore dell'intestino medio.

Questi eventi sono segnalati dai reporter GFP e DS RED. Il saggio di trasmissione indica che il virus GFP DS MRE 16 cinque prime esprime stabilmente GFP per tutto il periodo di incubazione estrinseco. Nel morso di questo esemplare di zanzara, GFP e la saliva della zanzara vengono rilevati già a partire da otto giorni dopo l'infezione.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come infettare oralmente un virus ATS in un morso, di come valutare visivamente l'infezione virale in un morso e di come valutare la trasmissione del virus da parte del morso.