Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale

Ciao, mi chiamo Alan e sono nel laboratorio del Dott. Horney Lu presso l'Università della California di Irvine, nel Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento. E io sono Bob. Oggi, il Dott. Haro vi mostrerà un protocollo rapido, efficiente e affidabile per la crioconservazione di routine di blocchi di tessuto corticale, al fine di ottenere successivamente colture primarie di neuroni di alta qualità.

Iniziamo. Il tessuto pulito e tritato viene caricato in provette criogeniche contenenti un mezzo di congelamento al 10% di TMSO.

Le provette criogeniche vengono inserite in un contenitore per congelamento e collocate a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Le provette criogeniche congelate vengono quindi trasferite nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per la coltura, la provetta criogenica di AC viene scongelata in un bagno d'acqua calda e risciacquata con HBSS caldo per rimuovere il DMSO residuo.

Viene aggiunto HBSS fresco insieme a tripsina per la dissociazione, dopodiché viene aggiunto DMM con 10% EBS. Per arrestare l'attività enzimatica dissociativa, le cellule vengono centrifugate e il pellet viene risospeso in DMM fresco più 10% EBS e seminato in piatti pre-ricoperti con polilisina. Dopo 24 ore, il DMM viene sostituito con un mezzo neurobasale supplementato e le cellule vengono coltivate per 10 giorni.

Questo protocollo utilizza una lametta di acciaio per tagliare il tessuto corticale prima dell'uso. La lametta deve essere sterilizzata in etanolo al 70% per almeno due ore. Una soluzione salina tampone di Hank (HBSS) 1x viene preparata diluendo una soluzione madre 10x in acqua sterilizzata; la soluzione HBSS 1x viene quindi conservata sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino all'elaborazione del tessuto.

L'ossido di dimetilsolfuro o DMSO viene utilizzato come crioprotettore nel mezzo di congelamento. Questo protocollo prevede una diluizione al 10% in volume/volume di DMSO in H-B-S-S-D-M-S-O uno X, che deve essere mescolato completamente prima di essere conservato a quattro gradi Celsius. Per controllare la velocità di congelamento dei campioni si utilizza un contenitore per congelamento Nalgene.

Il contenitore per il congelamento viene caricato con provette criogeniche da 2,5 millilitri che sono state etichettate in precedenza. È anche consigliabile etichettare i contenitori per il congelamento stessi, qualora se ne abbiano più di uno, e annotare il contenitore corrispondente sulla bile. Il mezzo di congelamento con DMSO al 10% precedentemente raffreddato, così come il contenitore per il congelamento, vengono portati all'interno di una cappa biologica sterile.

Qui, un millilitro di mezzo crioprotettivo viene aggiunto lentamente a ciascun vial criogenico. Dopo aver verificato che i tappi siano ben chiusi, posizionare il contenitore per il congelamento con i viali a quattro gradi Celsius per almeno due ore, immediatamente prima dell'elaborazione del tessuto. La lametta precedentemente sterilizzata deve essere sciacquata accuratamente. Tre lavaggi di tre minuti ciascuno.

L'uso di acqua sterilizzata dovrebbe essere sufficiente per rimuovere qualsiasi etanolo residuo. Questa procedura di lavaggio deve essere rapida poiché il rasoio è soggetto a ossidazione se immerso a lungo in acqua sterile. Prima della pulizia, il tessuto deve essere posizionato su un pacchetto di ghiaccio.

Risciacquare leggermente con una X-H-B-S-S fredda per rimuovere eventuali detriti liberi. Aghi sterilizzati vengono utilizzati per pulire i pezzi di tessuto da eventuali membrane residue e vasi sanguigni. È necessario prestare attenzione a preservare l'integrità strutturale del tessuto durante la pulizia.

Man mano che ciò aumenta, l'efficienza del taglio del tessuto pulito sarà visibilmente diversa rispetto a quella del tessuto grezzo e dovrebbe presentare la maggior parte delle membrane o dei vasi sanguigni rimossi. Una volta che un tessuto è stato pulito e risciacquato, si può iniziare il taglio. È importante effettuare tagli precisi del tessuto, creando blocchi di dimensioni approssimativamente pari a un millimetro cubo.

I blocchi troppo grandi determinano una resa cellulare inferiore al momento della scongelazione. I blocchi più piccoli, tuttavia, devono essere sottoposti a un eccessivo trattamento di lavorazione. Il tessuto tritato può essere raccolto utilizzando una pipetta automatica e un po' di soluzione X-H-B-S-S fredda e isotonica.

Assicurarsi di sciacquare la piastra con HBSS per recuperare tutti i tessuti raccolti. Il tessuto viene quindi aggiunto a un grande volume di HBSS 1X e lasciato sedimentare sul fondo, formando un pellet allentato. Questo passaggio elimina eventuali detriti residui presenti durante la sedimentazione del tessuto in HBSS. Recuperare il contenitore per congelamento precedentemente raffreddato e le provette criogeniche prima di distribuire il tessuto.

Assicurarsi di togliere il tappo da tutte le provette per accelerare il processo di riempimento del tessuto. L'esposizione al DMSO a temperatura ambiente non deve superare i 10 minuti. È consigliabile lavorare con un contenitore per il congelamento alla volta, fino a quando tutto il tessuto non è stato utilizzato.

Iniziare ad aspirare il sopranatante di un tessuto lento, posizionando il cono della pipetta il più vicino possibile al pellet senza disturbarlo. Quindi applicare una punta con orifizio da 200 microlitri a una pipetta. Non utilizzare una punta con orifizio più piccolo, poiché comprometterebbe la struttura dei blocchi che si depositano sul fondo del pellet del blocco di tessuto.

Prelevare 200 microlitri di tessuto lentamente. Aggiungere questo tessuto a una provetta criogenica e procedere con la successiva fino a quando tutte le provette non saranno piene. Potrebbe essere necessaria una regola dei 10 minuti.

Posizionare rapidamente il contenitore di congelamento nei vial criogenici e inserirli in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte, se il tempo è limitato. Dopo un tempo sufficiente, rimuovere il contenitore di congelamento dal congelatore e distribuire i vial criogenici in una scatola criogenica nel minor tempo possibile. Posizionare la scatola criogenica su un supporto all'interno di un contenitore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Rimuovere una provetta criogenica dall'azoto liquido nel modo più rapido possibile, limitando al minimo l'esposizione delle scatole criogeniche alla temperatura ambiente, che farebbe sciogliere rapidamente il campione immergendolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Mantenere sempre il tappo al di sopra del livello dell'acqua. Controllare frequentemente e continuare lo scongelamento fino a quando si osserva una piccola massa di ghiaccio.

Prima di portarla nella cappa di sicurezza, sterilizzare la provetta criogenica con etanolo al 70%. Procedere aggiungendo il tessuto scongelato a un grande volume di HBSS caldo uno X, se del tessuto rimane sulle pareti della provetta criogenica. Raccogliere delicatamente con HBSS.

Dopo aver raccolto tutti i tessuti, capovolgere il tubo da tre a quattro volte e lasciare sedimentare il tessuto sul fondo. Questo passaggio garantisce una diluizione sufficiente del DMSO.

Una volta che il tessuto si è depositato, aspirare il più possibile il sopranatante. Quindi aggiungere 10 millilitri di H-B-S-S fresco e caldo 1X. Aggiungere 300 microlitri di tripsina al 0,25% e 50 microlitri di DNAasi.

Procedere alla dissociazione del tessuto con agitazione delicata, ottenendo una sospensione cellulare torbida dopo il completamento della dissociazione. Arrestare l'attività enzimatica aggiungendo DMEM caldo più siero bovino arricchito al 10% (EPS) ed effettuare la centrifugazione delle sospensioni cellulari a 1200 ×g per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in DMEM fresco più 10% EBS e seminare su piastre rivestite con polilisina.

Lasciare che le cellule si attacchino alle piastre per 30 minuti. Quindi sostituire il mezzo con DM fresco più 10% EBS. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo contenente DM con mezzo neurobasale integrato con N due e B 27 e coltivare per 10 giorni.

Abbiamo appena descritto un protocollo vasto, efficiente e affidabile per la comune criopreservazione di blocchi di tessuto corticale. Buona fortuna.