Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico
30 marzo 2011
Questo protocollo descrive una procedura per studiare la respirazione dei mitocondri isolati da muscolo scheletrico. Questo metodo è stato adattato da Scorrano Et al. (2007). La procedura di isolamento dei mitocondri richiede circa 2 ore. La respirazione mitocondriale può essere completata in circa 1 ora.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri ed eseguire la respirazione mitocondriale. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il muscolo scheletrico da ratti spray dly. Successivamente, il muscolo viene omogeneizzato e i mitocondri sono isolati mediante centrifugazione.
La concentrazione proteica viene quindi determinata utilizzando il saggio di Bradford. Infine, la respirazione mitocondriale viene misurata mediante poligrafia. In ultima analisi, è possibile ottenere risultati che mostrano il consumo di ossigeno attraverso i diversi stati della respirazione mitocondriale.
Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del muscolo scheletrico, come l'effetto di diversi interventi sulla funzione mitocondriale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo del muscolo scheletrico, può essere applicato anche ad altri organi come fegato, cervello, rene o quasi qualsiasi tessuto prima di iniziare la procedura. Per isolare il muscolo scheletrico, preparare le seguenti soluzioni: P-B-S-P-B-S più 10 millimolare EDTA, otto volte il buffer per l'isolamento dei mitocondri, buffer di isolamento uno o IB uno, buffer di isolamento due o IB due e buffer sperimentale o eb.
Consultare il protocollo scritto allegato per le istruzioni. Successivamente, accendere la centrifuga e impostarla a quattro gradi Celsius. Accendere un bagno termico e impostarlo a 37 gradi Celsius.
In un bel contenitore, mettere tre becker da 10 millilitri, un gomito da imbianchino, macinatori per tessuti gem, piccole forbici chirurgiche e 10 provette da microcentrifuga sul ghiaccio. Tutto deve rimanere freddo sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. Posizionare IB uno e IB due sul GHIACCIO e EB in un bagno di acqua calda.
Quindi aggiungere le seguenti soluzioni ai tre becher posti sul ghiaccio: becher uno, 10 millilitri di PBS; becher due, 10 millilitri di PBS-EDTA; becher tre, 3 millilitri di ib. Uno. Eutanasia di un ratto secondo le procedure approvate dal comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali.
Successivamente, isolare rapidamente da 250 a 500 milligrammi di muscolo scheletrico con pinze e forbici Mayo Clinic. Sciacquarlo nel becher uno, quindi trasferirlo nel becher due, per omogeneizzare il muscolo. Prima, trasferirlo nel becher tre, e infine tritarlo con le forbici.
Trasferire la soluzione nel potter Elva gem e omogeneizzare il muscolo utilizzando un pestello motorizzato per 10 volte, mantenendo il tubo sempre sul ghiaccio. Successivamente, trasferire l'omogenato in provette microcentrifuga da due millilitri precedentemente raffreddate e centrifugare a 700 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il sopranatante S in una nuova provetta microcentrifuga pre-riempita e scartare il pellet ottenuto dalla centrifugazione.
Il surnatante S a 10.500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il SNAT in un nuovo tubo da microcentrifuga pre-riempito e etichettarlo con SN uno e tipo di muscolo Reese. Sospendere il pellet in 500 microlitri di IB due, quindi centrifugare a 10.500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il sopernatante in un nuovo tubo da microcentrifuga pre-riempito e etichettarlo con SN due e tipo di muscolo.
Sospendere il pellet mitocondriale finale in 100 microlitri di IB due. Centrifugare brevemente in una minicentrifuga per alcuni secondi. Se è presente un pellet, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da microcentrifuga pre-riempito e scartare il pellet. La calibrazione dell'elettrodo dell'ossigeno è un passaggio fondamentale di questo protocollo e deve essere eseguita quotidianamente.
La calibrazione dell'elettrodo può essere completata durante l'isolamento mitocondriale. Per iniziare, aggiungere 100 millilitri di acqua distillata in un matraccio da 250 millilitri e agitare vigorosamente per 20 minuti. Per equilibrare l'acqua con il gas atmosferico, coprire l'elettrodo GRAT con alcune gocce di cloruro di potassio al 50%.
Successivamente, posizionare un piccolo pezzo di carta da rullino blu Rizla sopra l'elettrodo. Poi un pezzo di membrana in PTFE sopra la carta da rullino.
Applicare l'anello interno utilizzando l'applicatore per anelli, quindi posizionare l'anello esterno nella scanalatura dell'elettrodo. Collegare gli elettrodi e assemblare la base dell'anello di plastica più grande, la camera mitocondriale e i tubi dell'acqua. Accendere i dispositivi GRAT e avviare il software GRAS.
Aggiungere l'acqua equilibrata alla camera mitocondriale. Quindi aggiungere una bacchetta magnetica per attivare l'agitazione. Fare clic su hardware.
Poi agitare a velocità. Regolare la velocità a 60 e fare clic su Avvia. Successivamente, iniziare un nuovo esperimento.
Fare clic su calibra e quindi su calibrazione della fase liquida. Per il box uno, modificare la temperatura a 37 gradi Celsius e fare clic su ok due volte. Quando la sostituzione passa a ok, fare clic su di essa e aprire la bombola di gas azoto.
Posizionare la punta collegata alla bombola di azoto nella camera e stabilire una condizione di ossigeno zero. Fare clic su ok quando il sistema passa da override. Aspirare l'acqua e aggiungere 500 microlitri di EB nelle camere mitocondriali.
Sigillare la camera con un pistone. Se si utilizzano più contenitori, ripetere a partire dal passaggio di calibrazione per ciascun contenitore. Avviare un nuovo esperimento e farlo proseguire per circa un minuto.
Per stabilizzare il segnale, aggiungere il volume necessario della sospensione di mitocondri per ottenere 150 microgrammi in ogni camera. Segnare l'evento e lasciare procedere. Per un minuto, aggiungere 10 microlitri di glutammato caldo 250 millimolari, malato 125 millimolari per una concentrazione finale di cinque millimolari di glutammato, 2,5 millimolari di malato, segnare e lasciare procedere per un minuto.
Questo è definito stato due. Successivamente, aggiungere 7,5 µL di DP 10 mM per una concentrazione finale di 150 µM. Quindi marcare e far procedere per 30 secondi.
Questo è definito come stato tre. Aggiungere altri 7,5 microlitri di DP 10 millimolare marcato e lasciare procedere per 1,5 minuti. Aggiungere 0,5 microlitri di oligomicina fredda 10 millimolare per una concentrazione finale di un micromolare marcato e lasciare procedere per tre minuti.
Questo è definito stato quattro. Aggiungere un microlitro di FCCP freddo 0,1 millimolare per una concentrazione finale di 0,2 micromolare, e lasciare RUM per tre minuti. Questo è definito stato cinque.
Al termine, concludere l'esperimento e salvarlo. Acquisire i tassi di respirazione utilizzando il software raft. Inserire il fattore di normalizzazione.
Se si aggiungono 150 microgrammi di proteina mitocondriale, il fattore di normalizzazione sarà 0,15. Calcolare le velocità di respirazione normalizzate per i diversi stati respiratori. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio o RCR dividendo lo stato tre per lo stato quattro.
Questa figura mostra un tracciato rappresentativo del consumo di ossigeno da parte del muscolo scheletrico. Mitocondri. Una volta stabilizzato il segnale dell'elettrodo, il campione di mitocondri viene aggiunto alla camera GRAT. La respirazione allo stato due inizia con l'aggiunta di glutammato e malato.
L'aggiunta di ADP aumenta il consumo di ossigeno. Definizione dello stato tre. La respirazione con la sintasi dell'ATP è bloccata mediante l'aggiunta di oligomicina per ottenere la respirazione nello stato quattro.
Infine, viene aggiunto FCCP per disaccoppiare la respirazione mitocondriale. Questo diagramma mostra i tassi rappresentativi di consumo di ossigeno per gli stati 2, 3, 4 e cinque. Il rapporto di controllo respiratorio, o RCR, viene calcolato per ogni esperimento.
Un RCR superiore a quattro è considerato un'indicazione di una preparazione di mitocondri vitale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere i campioni mitocondriali sempre sul ghiaccio. Dopo aver eseguito questa procedura.
Altri metodi, come i blotting Western, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come il contenuto delle proteine mitocondriali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico e della respirazione mitocondriale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una procedura per isolare i mitocondri dai muscoli scheletrici e misurare la loro respirazione. Il metodo consente la valutazione della funzione mitocondriale mediante l'analisi del consumo di ossigeno.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Metabolismo
Sfondo
- Le mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nella produzione di energia.
- Comprendere la respirazione mitocondriale è essenziale per lo studio dei disturbi metabolici.
- Questo protocollo è stato adattato da metodologie consolidate.
- L'isolamento dei mitocondri è fondamentale per misurare con precisione la loro funzione.
Scopo dello studio
- Isolare i mitocondri dal tessuto muscolare scheletrico.
- Misurare i tassi di respirazione mitocondriale.
- Analizzare il consumo di ossigeno in diversi stati di respirazione mitocondriale.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del muscolo scheletrico da ratti sottoposti a spray-drying.
- Omogeneizzazione del tessuto muscolare.
- Centrifugazione per isolare i mitocondri.
- Determinazione della concentrazione proteica mediante saggio di Bradford.
- Misurazione della respirazione mitocondriale mediante poligrafia.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di mitocondri da muscolo scheletrico.
- Valutazione quantitativa della respirazione mitocondriale.
- I risultati indicano un consumo di ossigeno variabile tra diversi stati respiratori.
Conclusioni
- Il protocollo isola efficacemente le mitocondri per studi sulla respirazione.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della funzione mitocondriale nei processi metabolici.
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori ricerche sul metabolismo muscolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di mitocondri funzionali dal muscolo scheletrico consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati a bersagli metabolici nella fase preclinica della scoperta. Letture quantitative della respirazione forniscono un'elevata affidabilità predittiva per la validazione dei bersagli e l'analisi dei percorsi metabolici. Questo metodo supporta decisioni precoci di avanzamento o interruzione dello sviluppo, stabilendo delle soglie di vitalità mitocondriale prima dello screening dei composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando la funzione mitocondriale al metabolismo del muscolo scheletrico e all'omeostasi energetica.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante l'isolamento standardizzato di mitocondri vitali con un rapporto di controllo respiratorio (RCR) ≥4 come parametro funzionale di riferimento.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale quantificando i rapporti di controllo respiratorio che riflettono l'integrità mitocondriale e l'efficienza dell'accoppiamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi mitocondriali validati per saggi biochimici e funzionali successivi, inclusi l'attività enzimatica e la proteomica.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione dei saggi mediante la calibrazione giornaliera dell'elettrodo dell'ossigeno e una normalizzazione costante delle proteine utilizzando il saggio di Bradford.
- Valore di scalabilità: Permette una valutazione affidabile dei composti attraverso misurazioni riproducibili della respirazione negli stati 2-5 in condizioni controllate di substrato e inibitore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza clinica studiando la respirazione mitocondriale nel muscolo scheletrico, un tessuto chiave nei disturbi metabolici.
- Valore operativo: Fornisce continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica mediante la misurazione quantitativa del consumo di ossigeno in diversi stati respiratori.
- Progresso ponderato rispetto al rischio: Guida le decisioni misurando la respirazione disaccoppiata (stato 5) e quella associata alla sintesi di ATP (stato 3) per valutare lo stato bioenergetico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione di composti promettenti, sostenendo programmi mirati alle mitocondri in ambito delle malattie metaboliche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando i mitocondri per chiarire i percorsi coinvolti nella sintesi dell'ATP e nel segnale metabolico.
- Screening: Garantisce la prontezza per saggi mediante misurazioni riproducibili della respirazione che permettono di confrontare gli effetti dei composti sul consumo di ossigeno.
- Analisi: Produce letture quantitative (respirazione negli stati 2-5, RCR) che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare diverse condizioni e valutare la funzione mitocondriale.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo dati funzionali sui mitocondri rilevanti per i modelli di metabolismo muscolare e di spesa energetica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di isolamento e respirazione riutilizzabile su diversi tipi di muscolo scheletrico e adattabile ad altri tessuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella vitalità mitocondriale, riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi sul metabolismo energetico.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle tecniche di isolamento mitocondriale e dei saggi di respirazione.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi su target metabolici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su rapporti di controllo della respirazione e profili di respirazione specifici per substrato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di isolamento mitocondriale, centrifugazione e misurazione della respirazione.
- È dipendente da strumentazione inclusa omogeneizzatori, centrifughe mantenute a 4°C, bagni termostatici a 37°C e sistemi polarografici con elettrodo di ossigeno.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione dei tamponi, alla calibrazione giornaliera dell'elettrodo e alla rigorosa manipolazione dei campioni a ghiaccio.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la regolazione della quantità di tessuto muscolare (250-500 mg) e del carico proteico mitocondriale (150 µg) in base ai diversi tipi di muscolo scheletrico.
- I limiti pratici comprendono la necessità di reagenti freschi, una finestra temporale breve per lo studio funzionale (~1 ora dopo l'isolamento) e la calibrazione giornaliera degli elettrodi di ossigeno.
