Sviluppo metodi per il trasporto dei macrofagi del sangue Borne Nanoformulated farmaci antiretrovirali

Lo scopo di questa procedura è produrre e testare il uptake cellulare, la secrezione e le proprietà antiretrovirali di nanoparticelle cristalline antiretrovirali, che definiamo nano art. Questo viene realizzato innanzitutto processando i farmaci antiretrovirali mediante omogeneizzazione ad ultrasuoni o macinazione a umido. Il secondo passaggio della procedura consiste nel caratterizzare le proprietà fisiche delle nanoparticelle nano art dopo che i monociti primari sono stati isolati mediante centrifugazione countercorrente.

Vengono coltivati per sette giorni in DMEM contenente il fattore di stimolazione delle colonie dei macrofagi, o MCSF, che induce la loro differenziazione in macrofagi derivati dai monociti. Il terzo passaggio consiste nel testare l'assorbimento, il mantenimento e il rilascio del nano ART in macrofagi umani derivati dai monociti. L'ultimo passaggio della procedura è testare l'efficacia antiretrovirale in vitro del nano ART in macrofagi derivati dai monociti.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'assorbimento facilitato e il rilascio lento di nano arte dalle cellule e una robusta efficacia antiretrovirale. Questi parametri sono determinati mediante la misurazione dei livelli del farmaco, tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC, e mediante la valutazione di materiali sopranatanti da colture infette attraverso la misurazione dell'attività della trascrittasi inversa. Ciao, sono Hanta Aldi e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio del Dott. Howard Gelman presso il centro medico dell'Università del Nebraska.

I metodi che presentiamo possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nella nanomedicina, come ad esempio in che modo i sistemi di somministrazione di farmaci basati su cellule possono essere utilizzati per sviluppare attività di ricerca traslazionale. Questo può essere ottenuto impiegando una terapia antiretrovirale formulata a livello nanometrico con emivite prolungate. I nostri studi supportano il potenziale utilizzo di nano art a scopo clinico.

Ciao, mi chiamo Ari Noche e sono uno studente borsista del programma MD PhD che lavora nel Laboratorio di Neuroscienze Emergenti Carol Schwartz. Sotto la guida del Dott. Gendelman, le implicazioni delle tecniche che vi mostriamo qui si estendono alla terapia antiretrovirale, poiché composti formulati su scala nanometrica possono simultaneamente migliorare la biodisponibilità e la farmacocinetica, riducendo al contempo gli effetti collaterali legati ai farmaci. Ripacchettando farmaci antiretrovirali clinicamente disponibili in nanoparticelle, potremmo essere in grado di migliorare l'aderenza alla terapia e influenzare positivamente l'esito delle malattie.

Ciao, sono il dottor Howard Gendelman. Sono un medico ricercatore e professore e direttore del Dipartimento di Farmacologia e Neuroscienze Sperimentali presso l'Università del Nebraska Medical Center. Il nostro obiettivo generale è semplificare i farmaci antiretrovirali per renderli più facilmente disponibili e migliorarne la biodistribuzione e la farmacocinetica.

Ora passo la parola ad Ari e Sean, che vi accompagneranno nel laboratorio di ricerca e vi mostreranno come vengono prodotti e sviluppati questi nanoparticelle. Utilizzo clinico e sviluppo presso il Centro Medico dell'Università del Nebraska. Per produrre nano particelle mediante macinazione a umido, pesare prima i cristalli del farmaco e i vari tensioattivi che verranno utilizzati per preparare le formulazioni nano e mescolarli con un tampone heis 10 millimolare a pH 7,8, usando un mixer T 18 Ultra Turx fino a completa dispersione. La percentuale del farmaco nella formulazione dovrebbe essere compresa tra l'1 e il 2% per la macinazione continua.

Assicurarsi che il refrigeratore e il compressore siano accesi e che la pressione in uscita sia di circa 100 PSI. Ora configurare il sistema in modo da poter caricare il mezzo di macinazione nel serbatoio e aggiungere 50 millilitri di sfere alla camera di macinazione. Utilizzando un imbuto, verificare che non ci siano sfere nelle filettature o in qualsiasi punto esterno alla camera di macinazione per evitare perdite nel sigillo meccanico. A questo punto, accertarsi che la guarnizione O-ring sia al suo posto sulla camera di macinazione.

Quindi selezionare un'adeguata dimensione della maglia del setaccio e fissare i coperchi serrando i dadi. La dimensione della maglia del setaccio deve essere almeno la metà rispetto a quella delle perle. Utilizzare una maglia del setaccio di dimensioni elevate per evitare che il prodotto ostruisca il filtro durante la macinazione continua.

Dopo aver abbassato la camera di macinazione, aggiungere la sospensione del farmaco con diverse quantità di surfattanti all'ingresso del prodotto. Il volume minimo della sospensione deve essere di 100 millilitri. Ciò impedirà il surriscaldamento della camera di macinazione e eviterà anche la contaminazione delle perle dovuta a un minore usura delle parti.

Successivamente, avviare la pompa. Utilizzando l'unità di controllo, è necessario variare la portata in base alla formulazione. Quindi accendere l'agitatore e regolare la velocità sull'unità di controllo.

La velocità può essere aumentata da 600 giri al minuto a 4.320 giri al minuto. Su un micro sur, monitorare la temperatura utilizzando il termometro collegato sulla parte superiore della camera di macinazione per assicurarsi che non si verifichi surriscaldamento. Macinare ora il campione a diverse velocità e portate ed estrarre piccole aliquote di circa un millilitro della formulazione per misurazioni di dimensione e carica mediante un analizzatore Malvern Zeta Sizer a diffusione della luce laser.

Dopo aver raggiunto la dimensione desiderata, arrestare la macinazione mediante l'unità di controllo e, mantenendo la pompa accesa, raccogliere il campione in un matraccio, permettendo al farmaco di defluire completamente. Ricordarsi di spegnere la pompa al termine e rimuovere e pulire le sfere. Trasferire ora la sospensione del mulino in provette da centrifuga da 50 millilitri e impostare la centrifuga a 10.000 giri al minuto per 30 minuti.

Al termine del ciclo della centrifuga, misurare la quantità di sate e sostituirla con la stessa quantità di soluzione di surfattante fresca. Una volta completata la sospensione di Resus, trasferire la sospensione nella camera di macinazione e macinare per 10 minuti. Prelevare un'aliquote di circa un millilitro e misurare nuovamente dimensione e carica del campione utilizzando il Zeta sizer.

Infine, misurare la concentrazione delle formulazioni di nano arte utilizzando HBLC per produrre nano arte tramite omogeneizzazione. Utilizzando Avastin Emulex C five, preparare i cristalli del farmaco e i vari tensioattivi come descritto in precedenza, trasferire la sospensione nel recipiente di omogeneizzazione e avviare la ricircolazione. Assicurarsi che il refrigeratore sia acceso prima di iniziare l'omogeneizzazione del campione.

Aumentare gradualmente la pressione fino a quando il manometro indica 20.000 più o meno 2000 PSI e continuare l'omogeneizzazione fino al raggiungimento della dimensione desiderata delle particelle. Ciò richiede di solito tra 45 e 60 minuti. Prelevare periodicamente un campione di circa un millilitro e misurare le dimensioni e la carica del campione utilizzando una centrifuga zeta sizer, come descritto in precedenza per la sospensione omogeneizzata.

Successivamente alla sospensione di Resus, trasferire la sospensione nell'omogeneizzatore C cinque. Riavviare la circolazione e riportare la pressione di omogeneizzazione a 20.000 ± 2000 PSI ed omogeneizzare per 30 minuti per produrre, mediante sonificazione, utilizzando il processore ad ultrasuoni Palmer freddo. Versare la soluzione di cloro metano PLGA e del farmaco in una soluzione di surfattante PVA al 1% e porre in bagno di ghiaccio nell'ultrasuono.

Iniziare la sonificazione al 50% di ampiezza, anche se l'ampiezza può essere ridotta fino a circa il 30% per quantitativi più piccoli di campioni; sonificare il campione per 10 minuti. Prelevare un'aliquote piccola per l'analisi della dimensione delle particelle. Se la dimensione delle particelle è superiore a 1,5 micron, sonificare i campioni a intervalli di due minuti fino a un massimo di 16 minuti totali.

Osservare i campioni al microscopio con un ingrandimento di 20 volte e documentare le osservazioni. Utilizzare un agitatore magnetico per creare un vortice adeguato della sospensione e continuare a mescolare tutta la notte a temperatura ambiente. Raccogliere la sospensione dopo 24 ore e versarla in provette da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare i campioni a una velocità di 8.000 giri al minuto per 20 minuti a cinque gradi SIU, decantare il soprannatante e risospendere una metà del campione in 75 millilitri di acqua filtrata ad osmosi inversa e l'altra metà in 75 millilitri di soluzione surfattante allo 0,5% di bromuro di cetiltrimetilammonio. Centrifugare nuovamente i campioni a una velocità di 8.000 giri al minuto per 20 minuti a cinque gradi Celsius e risospendere ciascun pellet con un totale di 20 millilitri di soluzione di mannosio. Infine, per le particelle prodotte mediante omogeneizzazione o sonificazione, misurare la dimensione delle particelle utilizzando lo zeta sizer e determinare la concentrazione dei campioni mediante HPLC.

Per preparare la visualizzazione mediante microscopia, prendere le sospensioni di nano arte preparate e sottoporle a sonificazione per 10 secondi al 20% di ampiezza con una sonda per sonificazione. Prendere una lamella per microscopio e posizionarla su un microscopio invertito. Sulla lamella.

Mescolare 15 microlitri della sospensione di nanostrutture con 100 microlitri di soluzione salina fosfato tamponata e mescolare aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, visualizzare le nanoparticelle utilizzando un obiettivo da 20 volte per osservarne la morfologia. I campioni possono anche essere preparati per la visualizzazione mediante microscopia elettronica a scansione.

Qui osserviamo immagini ottenute mediante microscopio elettronico a scansione a emissione di campo a bassa tensione A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F dopo l'isolamento di monociti circolanti mediante centrifugazione e la purificazione di monociti a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro in DMEM integrato con i seguenti additivi. Successivamente, si piastrano 2 × 10⁶ cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti all'interno di un'atmosfera umidificata, integrata con il 5% di anidride carbonica, e si coltivano per sette giorni per consentire ai monociti di differenziarsi in macrofagi, al fine di analizzare l'assorbimento cellulare e il recupero. Si mescola il nano art con il mezzo di coltura fino a una concentrazione finale di 100 micromolare e si aggiunge un millilitro di mezzo trattato in ogni pozzetto al tempo desiderato o quando le cellule sono completamente cariche di nano art.

Rimuovere tutto il mezzo di trattamento e lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS per eliminare eventuali particelle non internalizzate dalle cellule. Staccare le cellule aderenti dal fondo della pozzetta utilizzando un cell lifter e trasferirle in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri. Centrifugare ora le cellule a 1000 RCF a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Rimuovere il soprannatante e aggiungere 200 microlitri di metanolo al 100% alle cellule, quindi sciogliere il nano art mediante sonicazione breve del pellet con una sonda sonica a un'ampiezza del 20% per due-cinque secondi. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi del contenuto del farmaco. Il trattenimento intracellulare del nano art può inoltre essere visualizzato mediante microscopia elettronica a trasmissione dopo che le sezioni sono state preparate con un microtomo, come mostrato qui.

Consultare il testo allegato a questo articolo per i dettagli sull'analisi del rilascio di nano arch: trattare le cellule come precedentemente descritto per l'analisi dell'assorbimento cellulare e del campionamento. Tuttavia, invece di raccogliere le cellule dopo il lavaggio, sostituire il PBS con due millilitri di mezzo di coltura cellulare privo di MCSF e privo di nano art nei giorni indicati o quando il mezzo diventa giallo, sostituendone metà nel giorno desiderato. Raccogliere un millilitro di mezzo cellulare insieme alle cellule replicate ed elaborare per l'analisi del farmaco.

Per visualizzare in tempo reale l'assorbimento di nano art mediante microscopia bifocale, prelevare innanzitutto un DRE come vibrant e aggiungerlo al mezzo. Seguendo le istruzioni del produttore, aggiungere il mezzo contenente il colorante ai macrofagi derivati da monociti maturi, quindi risciacquare le cellule tre volte utilizzando un millilitro di mezzo di coltura per rimuovere l'eccesso di colorante. Mescolare ora nano art con il mezzo di coltura utilizzando nano art marcato fluorescentemente e aggiungere il mezzo di trattamento contenente nano art marcato. Immediatamente prima dell'acquisizione mediante microscopio confocale, acquisire un'immagine ogni 30 secondi per quattro ore utilizzando un obiettivo da 60 volte.

Infine, è possibile eseguire saggi di infezione e infettività per HIV-1. Trattare innanzitutto le cellule come descritto per la visualizzazione del rilascio di ART. Successivamente, nei giorni desiderati, rimuovere tutto il mezzo e sostituirlo con mezzo privo di MCSF contenente HIV-1 a un multiplo di infezione di 0,01 particelle virali per cellula e incubare per 24 ore.

Quindi rimuovere il mezzo virale e sostituirlo con un mezzo fresco privo di virus, coltivando le cellule per 10 giorni, sostituendo metà del mezzo ogni due giorni o secondo necessità per mantenere vive le cellule per 10 giorni dopo l'infezione. Raccogliere 10 microlitri di mezzo da ogni pozzetto, trasferendoli in una piastra a 96 pozzetti, e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi della trascrittasi inversa. Possono inoltre essere eseguiti successivi test di rilevamento dell'HIV-1 P24.

Qui possiamo osservare chiaramente la morfologia delle cellule esposte al virus a un'infezione multipla di 0,011 giorno dopo il trattamento con nano art. In questi macrofagi derivati da monociti, non vi è alcuna evidenza di infezione virale e i nanoparticelle sono chiaramente visibili nel citoplasma cellulare. Qui, le cellule sono state esposte al virus 10 giorni dopo il trattamento con nano art.

Alcune di queste cellule sono state infettate, come indicato dalla colorazione per P24 e dalla formazione di cellule giganti multinucleate, ma vi era ancora una protezione significativa rispetto alle cellule non trattate. Si noti che le nanoparticelle sono ancora visibili nel citoplasma delle cellule in B, ma non in misura pari a quanto osservato in a; queste strutture non sono presenti nelle cellule non trattate con nano art. In questi video confocali su cellule vive, osserviamo macrofagi marcati in verde e nano art marcati in rosso.

Qui possiamo osservare che le cellule accumulano pochissime nanoparticelle. Qui, invece, accumulano rapidamente le particelle, come indicato dall'aumento della fluorescenza rossa. Queste differenze rispecchiano i risultati ottenuti nell'analisi dell'assorbimento del farmaco mediante HPLC; inoltre, possiamo osservare che le cellule internalizzano attivamente le particelle.

La differenza tra le velocità di accumulo delle nanostrutture cellulari riflette gli effetti delle caratteristiche fisiche, come dimensione, forma e carica, sulle capacità dei macrofagi di internalizzare e trattenere le nanostrutture. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre nanostrutture mediante tecniche di omogeneizzazione per via umida e sonificazione. Questi sono metodi efficaci per la produzione di nanoparticelle antiretrovirali.

La macinazione umida e l'omogeneizzazione servono a frazionare cristalli di farmaco di dimensioni maggiori in nanoparticelle più piccole all'interno di tensioattivi lipidici, mentre una tecnica di sonificazione produce goccioline di farmaco di dimensioni nanometriche all'interno di un polimero. Inoltre, abbiamo dimostrato come utilizzare macrofagi derivati da monociti umani come piattaforma sperimentale per valutare il trasporto di nanostrutture. Il nostro metodo di prova consente una semplice valutazione della capacità delle particelle di essere internalizzate, trattenute e rilasciate dalle cellule, nonché della loro capacità di inibire la replicazione virale.

Questo consente al ricercatore di identificare le nano formulazioni artistiche che potrebbero avere le maggiori probabilità di successo in vivo e, in ultima analisi, di essere utilizzate in soggetti infetti. I risultati completi di questi esperimenti sono pubblicati nel nostro articolo Online Nano. L'articolo si intitola Combinazioni di Farmaci Antiretrovirali Nano Formulati Prolungano il Rilascio del Farmaco e le Risposte Antiretrovirali nei Macrofagi Infetti da HIV V uno, implicazioni per la Terapia del Neuro AIDS, pubblicato sul Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Grazie mille.