Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare cloni esprimenti cellulasi da una libreria metagenomica. Questo viene ottenuto innanzitutto riproducendo una libreria metagenomica precedentemente creata mediante un robot, seguito dall'incubazione della libreria replicata a 37 gradi Celsius per 24 ore. Viene miscolta la crescita dei cloni di e coli, quindi vengono aggiunti lisi, tampone e substrato alla libreria replicata.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'attività della cellulasi attraverso misurazioni spettrofotometriche dell'assorbanza effettuate con un lettore di piastre. Ciao, sono Keith del laboratorio di Steven Hallam del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo un procedimento per lo screening funzionale ad alto rendimento di librerie metagenomiche.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'attività della cellulasi biomin da librerie metagenomiche. Cominciamo dunque. Prima di iniziare questo protocollo, preparare una libreria metagenomica conservata in un formato di piastra a 384 pozzetti.

Questo studio ha utilizzato il vettore di controllo monocopia PCC SMID in combinazione con cellule e coli resistenti a Farge T uno, TRANSFECT max EPI 300 T uno resistenti, come ospiti della libreria per avviare questa procedura; rimuovere le piastre contenenti la libreria da -80 gradi Celsius e scongelarle a 37 gradi Celsius per circa 20 minuti. Nel frattempo, utilizzare la funzione di sterilizzazione con luce UV presente sul QIX due per sterilizzare il robot per 15 minuti. Configurare il Q fill tre seguendo le istruzioni del produttore, con la bottiglia del mezzo collegata al collettore tramite il tubo sterile programmato.

Impostare il Q fill three con la quantità appropriata di terreno e regolarlo in modo da dispensare un volume di 45 microlitri. In ciascun pozzetto, eliminare l'aria dai tubi e dal collettore utilizzando la funzione di spurgo del robot finché non si visualizza il terreno. A ogni ago del collettore, riempire il numero desiderato di piastre con terreno LB utilizzando il Q fill three.

Ogni piastra richiede circa 20 secondi per essere riempita. Successivamente, caricare le piastre della libreria e le piastre nuove nelle aree appropriate dei Q pick. Riempire in modo automatico i bagni di pulizia con i reagenti appropriati.

2% micro 90 nel bagno posteriore, acqua distillata in autoclave nel bagno centrale e 80% etanolo nel bagno anteriore. Utilizzando il programma di replicazione del qix two, selezionare la testina appropriata, nonché il numero e i tipi di piastre di origine e di destinazione. Impostare anche la pulizia della testina tra una replicazione e l'altra.

Di solito, sei cicli in ogni bagno sono sufficienti. La capacità della macchina è di 10 piastre alla volta. Impostare la macchina in funzione.

Sono necessari circa 15 minuti per eseguirne la replicazione. Capacità massima con una testa da 384 pin. Una volta replicate le piastre, coltivarle a 37 gradi Celsius per 24 ore in una scatola umidificata.

Il lungo tempo di incubazione è necessario poiché un elevato numero di copie di smid viene indotto con l'aggiunta di arabinosio. Nel frattempo, pulire il robot Q fill three come descritto nel protocollo scritto. Al termine dell'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Mettere da parte i coperchi e posizionare le piastre sulla piattaforma di caricamento del magazine fornita con il rapid stack. Assicurarsi di tenere traccia dell'ordine delle piastre, poiché il software non lo fa. Verranno lette le piastre in fondo alla pila.

Prima di tutto, rimuovere un caricatore dallo stack rapido. Assicurarsi che sia vuoto e inserirlo nella pila di piastre da leggere. Afferrare il caricatore per la maniglia e la piastra dovrebbe caricarsi automaticamente nel caricatore.

Inserire il caricatore nello stack rapido nella corretta orientazione. Aprire il programma di scansione sul computer collegato. Selezionare una nuova sessione e assegnarle un nome appropriato.

Scegliere una piastra piatta a fondo piatto da 384 pozzetti come piastra. Digitare nell'area del layout della piastra. Selezionare il pulsante della procedura guidata e scegliere di aggiungere 384 campioni sconosciuti alla piastra.

Nell'area del protocollo, selezionare l'opzione ciclo di pozzetti e impostarla su 384 pozzetti. Un'icona del ciclo di pozzetti apparirà nell'albero del flusso sul lato sinistro dello schermo. Selezionare l'icona e fare clic per aggiungere la misurazione fotometrica.

Impostarlo per leggere a 600 nanometri. Salvare il protocollo con un nome univoco e chiudere il programma di scansione. Quindi aprire il programma Polara RS.

Nella pagina principale è presente una tabella che elenca gli strumenti collegati al dispositivo rapid stack sotto l'intestazione VARI scan; fare clic sull'opzione run session. Dovrebbe quindi apparire la finestra del saggio con un diagramma di flusso al centro. Selezionare l'elemento run session, quindi individuare il nome della scansione salvata.

Rieseguire nel menu a discesa che appare sul lato destro dello schermo. Una volta selezionato il protocollo, fare clic su "esegui". In questo saggio, apparirà una finestra che chiede quale magazzino utilizzare come sorgente e quale magazzino è vuoto.

La casella inferiore sullo schermo corrisponde alla rivista frontale. Assicurarsi che sia il caricatore rapido che la scansione Vario siano accesi, quindi fare clic su avvia. Il caricatore rapido caricherà automaticamente le piastre nel lettore di piastre, consentendo misurazioni continue delle piastre.

Osservare il caricamento della prima piastra nello scanner Vario per assicurare un corretto allineamento delle macchine per la lettura. La scansione di 25 piastre richiede circa 50 minuti. Al termine della scansione di Barrios, rimuovere la cassetta piena e posizionarla sulla piattaforma di caricamento delle cassette.

Sollevare il rettangolo esterno della piattaforma e il caricatore dovrebbe scivolare via, lasciando le piastre in piedi, impilate al centro. Infine, rimettere i coperchi sulle piastre per uno schermo basato su soluzione. Per l'attività sulla cellulosa, preparare prima il mix per il saggio utilizzando una soluzione concentrata 10 volte di lisi già pronta.

Aggiungere il tampone di acetato di potassio 50 millimolari a pH 5,5 come descritto nel protocollo scritto. Preparare quindi una soluzione madre contenente fino a 75 milligrammi per millilitro di substrato cromogeno DIPHENYL o DNP biocida cellulare in DMSO, assicurandosi che il substrato sia completamente disciolto. Aggiungere la soluzione madre di biocida cellulare DNP alla miscela per il saggio fino a raggiungere una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro.

Tenere presente che ogni piastra utilizza circa 20 millilitri di soluzione e sono necessari ulteriori 50 millilitri per compensare il volume morto. Impostare il Q fill three come in precedenza al mix per il saggio per ciascuna piastra utilizzando il Q fill three. Ogni piastra richiede circa 20 secondi per essere riempita.

Dopo aver aggiunto la miscela per il saggio, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. In una scatola umidificata, rimuovere le piastre dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Mettere da parte i coperchi e posizionare le piastre sulla piattaforma di caricamento del magazine fornita con il rapid stack, nello stesso modo di prima.

Aprire il programma scan its re e configurarlo come fatto in precedenza, con l'eccezione della misurazione fotometrica, che deve essere impostata per leggere a 400 nanometri. Quindi inserire i parametri nel programma POLARA RS, come mostrato in precedenza.

Consentire alla scansione Vario di leggere le piastre. Al termine della corsa, rimuovere e smaltire le piastre. Per esportare le letture di assorbanza, aprire il software di scansione e selezionare.

Aprire un file esistente. Selezionare la directory in cui è stata salvata la sessione e premere l'icona con il segno più per espandere l'elenco. Sotto l'intestazione del titolo saranno presenti opzioni denominate contenitore uno fino a contenitore N. A seconda del numero di piastre, selezionare dal menu in alto nella pagina la prima piastra da analizzare, quindi scegliere esporta rapporto dati.

Scegliere le opzioni di esportazione, come la disposizione della piastra e i dati fotometrici. Fare clic su Visualizza rapporto, quindi su Salva file. Selezionare la directory desiderata.

Il formato di output è un foglio di calcolo Microsoft Excel. Qui, le letture di assorbanza provenienti da una singola piastra a 384 pozzetti contenente un clone positivo mostrano, come indicato, un marcato aumento dell'assorbanza rispetto ai cloni che non esprimono attività cellulasi.

Le differenze nel tempo di saggio, nel pozzetto, nella posizione sulla piastra o nella concentrazione di DNP possono influenzare le letture assolute di assorbanza. Letture di assorbanza relative, come la differenza di assorbanza rispetto alla media della piastra o alla media della colonna, rappresentano un metodo più affidabile per identificare i cloni positivi per cellulasi. Vi abbiamo appena mostrato come identificare i cloni positivi per cellulasi da una libreria metagenomica.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di sciogliere il DNP cell bio side in DMSO e di incubare le piastre in una camera umidificata. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.