Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye
5 novembre 2010
Dimostrazione di quantificazione del dsDNA utilizzando sonde molecolari PicoGreen colorante e Hitachi F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di un accessorio lettore di micropiastre.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la capacità dello spettrofotometro fluorescente F 7,000 con lettore di microplacche di eseguire la quantificazione del DNA a doppio filamento utilizzando il colorante Pico green. Questo viene realizzato preparando innanzitutto i campioni e i reagenti. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'impostare lo strumento.
Il terzo passaggio della procedura consiste nel caricare i campioni nel lettore di micropiastre. L'ultimo passaggio della procedura è l'esecuzione della misurazione degli standard e dei campioni. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano una curva di calibrazione lineare, che può essere utilizzata per la quantificazione del DNA a doppio filamento di campioni sconosciuti.
Accendere lo spettrofluorimetro Hitachi F 7,000 per permettere alla lampada allo xenon di riscaldarsi per un'ora in Excel. Creare un file contenente i dati dei campioni e degli standard e salvarlo in formato valori separati da virgola o CSV. Per configurare lo spettrofluorimetro, fare prima clic sul pulsante metodo, che apre la finestra del metodo di analisi.
Nel campo di misurazione, selezionare la fotometria dal menu a discesa. Fare ora clic sulla scheda di quantificazione. Nel campo del tipo di quantificazione, selezionare lunghezza d'onda per indicare che la lettura della fluorescenza verrà effettuata utilizzando una lunghezza d'onda specificata.
Per il tipo di calibrazione, selezionare il primo ordine e per il numero di lunghezze d'onda selezionare uno. Inserire nanogrammi per millilitro come unità di concentrazione. Assicurarsi che le caselle di calibrazione manuale e forzatura della curva attraverso lo zero non siano selezionate. Dopo il punto decimale, selezionare due, inserire zero per il limite inferiore di concentrazione e 10.000 per il campo del limite superiore di concentrazione.
Successivamente, fare clic sulla scheda dello strumento e nel campo modalità dati selezionare fluorescenza. Verificare che il campo velocità di modulazione sia inattivo, poiché viene utilizzato esclusivamente per le misurazioni di fosforescenza. Nel campo modalità lunghezza d'onda, selezionare entrambi WL fissato nel campo ex WL uno e inserire 480 nanometri nel campo EM WL uno.
Immettere 520 nanometri. Lasciare tutti gli altri campi sotto EX e EM inattivi. Impostare sia la fenditura EX che la fenditura EM a 5,0 nanometri.
Utilizzando i menu a discesa, lasciare deselezionata la casella davanti al campo della tensione del PMT da 1 a 1000 volt. Per la tensione del PMT, selezionare 700 volt dal menu a discesa. Inoltre, selezionare due per il numero di calcoli statistici automatici, uno per le repliche, 0,1 secondi per il tempo di integrazione e zero per il ritardo.
Ora aprire la scheda monitor e impostare il campo massimo dell'asse y a 10.000 e il minimo dell'asse y a zero. Quindi selezionare la casella a sinistra di "elabora i dati dopo l'acquisizione" e, se necessario, la casella a sinistra di "stampa il rapporto dopo l'acquisizione" per ottenere un rapporto che verrà stampato automaticamente al termine delle letture. Infine, per salvare tutti i parametri selezionati nelle diverse schede della finestra del metodo di analisi, fare clic sulla scheda generale e salvare con un nuovo nome file in una posizione specificata.
Fare clic sul pulsante OK per chiudere questa finestra. In questo modo si completa la configurazione dei parametri del test dello strumento. Per configurare il lettore di micropiastre, fare clic sul pulsante MPR per portare in primo piano la finestra di configurazione del MPR.
Selezionare innanzitutto le pozzette per gli standard. Ad esempio, fare clic sulla posizione A1 e trascinare il mouse fino alla posizione E1. Quindi fare clic sul pulsante imposta standard.
Questo selezionerà le posizioni da utilizzare per gli standard, evidenziate in colore verde. Successivamente, selezionare le posizioni per i campioni. Analogamente, fare clic e trascinare il mouse sulle posizioni corrispondenti della piastra, quindi fare clic sul pulsante del set di campioni, che evidenzierà automaticamente le posizioni selezionate in giallo.
Continuare a ripetere la stessa operazione per le posizioni in cui si desidera effettuare le misurazioni del campione. Per caricare le informazioni relative agli standard e ai campioni nel file di variabili separato da virgole preparato in precedenza, fare clic sulla scheda informazioni pozzetti della finestra di configurazione MPR.
Selezionare il pulsante per le informazioni sui pozzetti e si aprirà una finestra di Windows Explorer per identificare il file CSV con le informazioni sui pozzetti. Dopo aver caricato le informazioni, la finestra dovrebbe visualizzare una tabella. Per preparare una soluzione lavorativa del reagente Pico green, aggiungere 50 microlitri di reagente Pico green 200 X a 9,95 millilitri di tampone TE.
Per la curva standard, preparare delle diluizioni seriali di DNA bicatenario Lambda in tampone TE per ottenere concentrazioni finali comprese tra 1 e 100 nanogrammi per millilitro; pipettare 150 microlitri di ogni standard nelle pozzette designate di una piastra a 96 pozzette. Successivamente, pipettare 150 microlitri di ciascun campione da analizzare nelle corrispondenti pozzette designate della piastra. A questo punto, utilizzando una multicanale, aggiungere 150 microlitri di soluzione Pico green in ogni pozzetta e mescolare la soluzione con i campioni di DNA.
Incubare delicatamente la piastra in un'area buia per due-cinque minuti per consentire lo sviluppo della reazione. Fare clic sul pulsante dello schermo del MPR per portare la finestra di configurazione del MPR in primo piano sul display e fare clic sul pulsante di scambio posizione. La piattaforma di supporto per la micropiastra si sposterà verso la parte anteriore dello strumento, aprirà la porta del lettore di micropiastre e posizionerà la piastra a 96 pozzetti sulla piattaforma di supporto con il pozzetto A1 rivolto verso l'anteriore, quindi chiuderà la porta del lettore di micropiastre.
Fare clic sul pulsante della posizione iniziale per posizionare il punto A di una delle micropiastre nella posizione di misurazione. Fare clic sul pulsante di visualizzazione del monitor per portare la finestra di misurazione in primo piano sul display. Fare clic sul pulsante di misurazione per iniziare a misurare gli standard e i campioni sconosciuti.
Una curva di calibrazione valida viene valutata utilizzando i diversi parametri forniti dal software F 7,000. Ad esempio, questa curva di calibrazione ideale ottenuta per la quantificazione del DNA a doppio filamento mediante il colorante Pico green presenta un coefficiente di determinazione calcolato pari a 0,99993. Il sistema ad alta produttività descritto è un assemblaggio seriale di tecnologie che include il colorante Pico Green, uno spettrofotometro fluorescente Hitachi F 7,000 dotato di lettore per micropiastre e un programma software per automatizzare la raccolta, l'archiviazione, l'analisi e la presentazione dei dati.
La combinazione di tecnologie avanzate può soddisfare la crescente necessità di analizzare con precisione piccole quantità di DNA a doppio filamento.
Panoramica
In questo articolo viene illustrata la quantificazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) mediante l'utilizzo del colorante PicoGreen e dello spettrofotometro a fluorescenza Hitachi F-7000 abbinato a un lettore di micropiastre. La procedura descrive la preparazione dei campioni, l'impostazione dello strumento e le fasi di misurazione per ottenere una curva di calibrazione lineare per la quantificazione del dsDNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Spettroscopia di fluorescenza
- Quantificazione del DNA
- Tecnologia di lettura di microplacche
Sfondo
- Il colorante PicoGreen è un colorante fluorescente sensibile utilizzato per la quantificazione del DNA a doppio filamento.
- Il Hitachi F-7000 è uno spettrofotometro a fluorescenza versatile.
- Una quantificazione accurata del DNA è essenziale per diversi esperimenti biologici.
- I sistemi ad alto rendimento facilitano l'analisi di più campioni simultaneamente.
Scopo dello studio
- Dimostrare la capacità dello spettrofotometro F-7000 nella quantificazione del DNA a doppio filamento (dsDNA).
- Stabilire un metodo affidabile per la misurazione di campioni di DNA sconosciuti.
- Creare una curva di calibrazione lineare per una quantificazione accurata.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del reagente PicoGreen e dei campioni standard di DNA.
- Impostazione dei parametri dello spettrofotometro Hitachi F-7000.
- Caricamento dei campioni nel lettore di micropiastre.
- Misurazione della fluorescenza per generare una curva di calibrazione.
Risultati principali
- È stata stabilita una curva di calibrazione lineare per la quantificazione del dsDNA.
- Il metodo ha dimostrato un'elevata sensibilità e accuratezza.
- I risultati hanno mostrato un coefficiente di determinazione di 0,99993.
- Il sistema ha analizzato efficacemente piccole quantità di dsDNA.
Conclusioni
- La combinazione del colorante PicoGreen e dello spettrofotometro F-7000 fornisce un metodo affidabile per la quantificazione del DNA.
- Questo approccio ad alto rendimento soddisfa le esigenze di analisi accurate nella ricerca biologica.
- Il metodo può essere applicato a diversi studi che richiedono misurazioni precise del DNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
La quantificazione accurata del DNA a doppio filamento è un requisito fondamentale per la validazione degli obiettivi, lo sviluppo di saggi e la generazione di modelli preclinici nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica. Il fluorospectrofotometro Hitachi F-7000 con il colorante PicoGreen consente una misurazione altamente sensibile e ad alto rendimento del dsDNA, supportando la generazione affidabile di curve standard per applicazioni successive. Questo metodo fornisce una previsione affidabile nella quantificazione degli acidi nucleici, riducendo la variabilità nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta e permettendo la generazione scalabile e riproducibile di dati in studi di screening di composti e di biomarcatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la misurazione precisa delle concentrazioni di dsDNA per clonaggio, trasfezione e saggi di convalida dell'obiettivo basati su PCR.
- Valore operativo: Supporta la preparazione e la quantificazione riproducibile dei campioni, riducendo la variabilità tecnica negli esperimenti guidati da ipotesi.
- Valore predittivo: Genera curve di calibrazione lineari con elevati coefficienti di determinazione (R² > 0,999), garantendo una quantificazione accurata di campioni sconosciuti negli studi di interazione con l'obiettivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative di fluorescenza compatibili con formati a 96 pozzetti per la standardizzazione dei saggi e la titolazione dei reagenti.
- Valore operativo: Consente una misurazione rapida di 96 pozzetti in meno di 60 secondi utilizzando la modalità cinetica, favorendo la prontezza per schermature ad alto rendimento.
- Scalabilità: Il software permette di salvare e richiamare le configurazioni delle micropiastre, facilitando un'allestimento del saggio coerente tra team e progetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce una quantificazione affidabile di DNA a doppio filamento per l'analisi dei biomarcatori, la validazione della PCR e la produzione di vettori in modelli preclinici.
- Controllo del rischio: L'elevata sensibilità (equivalente a 50 picomoli di fluoresceina) e l'ampio intervallo dinamico (5 ordini di grandezza) consentono una quantificazione accurata su serie di diluizioni, riducendo i falsi negativi nei bersagli a bassa abbondanza.
- Integrazione del flusso di lavoro: Genera dati in formati Excel o rapporti, permettendo un trasferimento senza interruzioni ai flussi bioinformatici e analitici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo fino allo sviluppo preclinico, in cui una quantificazione accurata degli acidi nucleici è essenziale per la riproducibilità sperimentale e l'integrità dei dati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo una misurazione precisa del DNA a doppio filamento per valutare l'efficienza del clonaggio, l'analisi dell'espressione genica e gli studi di mutagenesi.
- Screening: Fornisce output fluorescenti quantitativi e riproducibili che supportano la robustezza dei saggi e la normalizzazione delle librerie di composti.
- Analisi: Genera curve di calibrazione lineari e coefficienti di determinazione (R²) che permettono il confronto tra esperimenti e il controllo di qualità.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la quantificazione affidabile del DNA in formulazioni farmacologiche, vettori virali e saggi per biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Un software configurabile e protocolli standardizzati consentono il riutilizzo tra diversi reparti, riducendo lo sviluppo ripetitivo di metodi e aumentando l'efficienza operativa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: L'elevata sensibilità e specificità per il DNA a doppio filamento riducono i segnali falsi e migliorano l'affidabilità dei dati nei saggi molecolari.
- Valore operativo: La raccolta, conservazione e presentazione automatica dei dati tramite software riducono al minimo le operazioni manuali e gli errori di trascrizione.
- Valore strategico: Una quantificazione affidabile supporta le decisioni di avanzamento o interruzione nell'ottimizzazione dei composti leader, garantendo dosaggi e normalizzazioni accurati nei saggi funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio fornendo dati affidabili sulle acidi nucleici per la selezione dei candidati e gli studi di formulazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con la spettroscopia di fluorescenza e il funzionamento del lettore a micropiastre.
- Necessita l'accesso a uno spettrofotometro Hitachi F-7000 dotato di accessorio per lettore a micropiastre e software compatibile.
- Richiede una preparazione standardizzata dei reagenti (diluizione di PicoGreen in buffer TE) e un'accurata manipolazione dei campioni per evitare l'oscuramento della fluorescenza.
- Comprende l'ottimizzazione del tempo di incubazione (2–5 minuti al buio) e delle impostazioni delle lunghezze d'onda (Es 480 nm, Em 520 nm) per garantire coerenza del segnale.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di incubazione al buio e il potenziale interferente di contaminanti o solventi organici.
