Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare la presenza di varianti specifiche nella proteina BRCA1 mediante un saggio in vitro di ricombinazione omologa. Questo viene ottenuto sostituendo la proteina BRCA1 di tipo selvaggio endogena con la variante in esame attraverso la trasfezione, in un primo passaggio, di RNA interferenti specifici per BRCA1 e di un plasmide per la re-espressione delle proteine varianti di BRCA1 da testare. In un secondo passaggio, l'RNA interferente e il plasmide per l'espressione della variante mutata di BRCA1 vengono co-trasfettati insieme a un plasmide per l'espressione della proteina ISCE1, che induce un danno al DNA in un sito specifico del genoma della cellula in esame. Successivamente, le cellule vengono incubate per due o tre giorni per consentire il verificarsi del danno e della riparazione del DNA. I risultati ottenuti indicano se specifiche varianti proteiche della proteina BRCA1 siano funzionali nel processo di riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa, in base all'analisi mediante citometria a flusso delle cellule che esprimono GFP.

Questa tecnica combina due metodi consolidati al fine di creare un sistema versatile per l'analisi di specifiche varianti proteiche nel riparo dei danni al DNA mediante ricombinazione omologa. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i metodi precedentemente stabiliti si basavano su linee cellulari con un knockout genetico di BRCA1. Utilizziamo una linea cellulare più agevole derivata da cellule HELOC che consente l'esaurimento di BRCA1 mediante interferenza dell'RNA della proteina endogena e il reintegro della proteina di prova in queste cellule.

Ora, esprimendo una variante della proteina BRC1, possiamo eseguire un test per la ricombinazione omologa. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della morte cellulare eccessiva durante la procedura. È fondamentale impostare con attenzione le condizioni di transfezione, massimizzando l'effetto della reazione di ricombinazione e limitando al contempo la citotossicità.

Prima dell'inizio di questo protocollo, la linea cellulare hela DR 13 nine è stata ottenuta trasfettando cellule hela con il plasmide P-D-R-G-F-P. Mantenere la linea cellulare su piastre di Petri da 10 centimetri in puromicina per la selezione delle cellule stably trasfettate. Il substrato di ricombinazione presente nel plasmide P-D-R-G-F-P e nei transformanti stabili contiene due alleli inattivi di GFP. Uno degli alleli è inattivo a causa dell'inserimento del sito di riconoscimento di 18 paia di basi per l'enzima di restrizione ISCE uno.

Nella sua sequenza codificante, l'espressione di ISCE1 in queste cellule genera un'interruzione del DNA a doppio filamento (DSB) sul secondo allele di GFP inattivo. La porzione della sua sequenza correlata al sito I-SCEI sul primo allele è di tipo selvaggio. Questo secondo allele di GFP può fungere da donatore di sequenza per la riparazione mediante ricombinazione omologa del DSB e porterebbe alla formazione di un allele di GFP attivo, facilmente rilevabile mediante citometria a flusso il giorno precedente al primo transfezionamento.

Prelevare una piastra da 10 centimetri di cellule HeLa DR 13-9 con una confluenza di almeno il 90%. Incubare le cellule con tripsina in un millilitro per due-tre minuti. Arrestare la reazione aggiungendo nove millilitri di D-M-E-M-F-B-S e mescolare bene la sospensione cellulare mediante pipettaggio. Aggiungere 40 microlitri di cellule trypsinizzate per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti, in 0,5 millilitri di D-M-E-M-F-B-S, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte.

Al primo giorno, le cellule dovrebbero avere una confluenza compresa tra il 40 e il 50%. Iniziare la trasfezione mescolando sia l'irna per esaurire la b RCA endogena uno sia il plasmide esprimente la mutante B RCA uno in mezzo ottimale. Successivamente, combinare gli acidi nucleici con il lip in mezzo ottimale.

Procedere con la trasfezione mediante lipectomia secondo le istruzioni del produttore dopo la trasfezione. Reintrodurre le cellule nell'incubatore. Sostituire il mezzo di coltura quattro-sei ore più tardi con un mezzo privo di antibiotici.

Riportare le cellule in incubazione durante la notte al secondo giorno. Dopo una breve incubazione a 37 gradi Celsius, aggiungere 0,3 millilitri di reagente trip trip tripsina in ogni pozzetto per trattare le cellule, quindi staccarle aspirando e dispensando su e giù nel reagente tripsina. Una volta completata la tripsinizzazione, trasferire le cellule dalla piastra a 24 pozzetti a una piastra a 6 pozzetti contenente due millilitri di D-M-E-M-F-B-S per arrestare l'attività della tripsina.

Lasciare che la piastra a sei pozzetti incubi tutta la notte nelle stesse condizioni di due giorni dopo la transfezione iniziale. Preparare il SIR A, il DNA plasmidico mutante BRCA1 e il plasmide ISCE1 in 62,5 microlitri di Optum. Mescolare questa soluzione con 2,5 microlitri di LIPECTOMY 2060 e 2,5 microlitri di Optum.

Procedere alla trasfezione delle cellule dopo un'incubazione di quattro-sei ore. Sostituire il mezzo con D-M-E-M-F-P-S privo di antibiotici. Reintrodurre le cellule nell'incubatore al sesto giorno.

Incubare le cellule in ogni pozzetto con 0,5 millilitri di reagente tripsina. Arrestare la reazione aggiungendo due millilitri di D-M-E-M-F-B-S e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in un millilitro di D-M-E-M-F-B-S fresco ed analizzare 10.000 cellule per pozzetto per l'espressione di GFP.

Mediante citometria a flusso, le singole cellule vive vengono selezionate utilizzando parametri di diffusione anterograda e dimensionale. Le cellule positive per GFP vengono rilevate tramite il detector della fluorescenza GFP e i risultati sono presentati come un istogramma. Le cellule rimanenti possono essere riseminata per la ripresa fotografica mediante fluorescenza.

La microscopia del BRCA1 desiderato regola il percorso di riparazione delle rotture del DNA a doppio filamento mediante ricombinazione omologa. Le cellule che hanno subito riparazione mediante ricombinazione omologa sono facilmente rilevabili mediante microscopia fluorescente. L'esaurimento del BRCA1 mediante RNAi determina una netta diminuzione delle cellule positive per GFP rilevate.

L'output dell'FCA è un istogramma con l'intensità di GFP per cellula sull'asse X e il numero di cellule sull'asse Y. In assenza del plasmide esprimente transfezionato, non vengono rilevate cellule positive per GFP.

I risultati nelle colonne da due a sei sono stati tutti ottenuti da cellule in cui il plasmide esprimente ISC uno è stato trasfettato al terzo giorno. In un insieme tipico di risultati provenienti da un singolo esperimento, il 15,5% delle cellule risulta positivo per GFP dopo l'espressione di ISC uno e l'abbattimento mediante RNAi di controllo per un gene irrilevante; al confronto, l'abbattimento di BRCA uno e l'inserimento di un vettore plasmidico vuoto riducono la conversione GFP allo 0,7%. L'aggiunta di BRCA uno esogeno di tipo selvatico ripristina completamente la ricombinazione omologa, come evidenziato dal recupero di cellule positive per GFP nel range dal 15 al 16%.

Allo stesso modo, l'espressione di un'altra variante di significato sconosciuto. La mutazione BRCA1 I21B ha completamente ripristinato la funzione di ricombinazione omologa dipendente da BRCA1. Il ripristino della variante mutante BRCA1 M18T ha avuto un effetto simile a quello del controllo con vettore.

Poiché questa variante è espressa a livelli simili a quelli della proteina endogena, ciò suggerisce che la variante BRCA1 M18T sia non funzionale nel processo di ricombinazione omologa. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di monitorare la crescita delle cellule, che si dividono lentamente e a bassa confluenza, e che la quantità di miscela di trasfezione utilizzata deve essere ridotta. È inoltre fondamentale rimuovere tempestivamente il mezzo di trasfezione.

Nei giorni successivi alla trasfezione, osserviamo un elevato livello di citotossicità se nel mezzo sono presenti antibiotici. Per questo motivo, tutto il mezzo utilizzato dopo il primo giorno non contiene antibiotici dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del cancro al seno per esplorare la genetica delle varianti di BRC1 con significato clinico sconosciuto nelle cliniche oncologiche.

Speriamo che il saggio funzionale per BRC uno sviluppato in questo studio permetta una previsione migliore degli effetti delle varianti di BRC uno sulla predisposizione al cancro.