Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere dati rappresentativi privi di bias all'interno di un campione limitato e analizzare con precisione la complessa struttura tridimensionale del tessuto. Questo risultato si ottiene innanzitutto acquisendo sezioni virtuali di istochimica immuno su sezioni pancreatiche colorate chimicamente. Successivamente, le sezioni virtuali vengono quantificate mediante la macro per sezioni virtuali IHC nel software ImageJ, e i dati vengono analizzati con script scritti per Mathematica.

Successivamente, viene eseguita una ricostruzione 3D delle sezioni virtuali utilizzando ImageJ. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'acquisire una serie di immagini individuali delle isole mediante il software slide book e nel mappare manualmente le serie di immagini in tre dimensioni utilizzando stereo investigator. In definitiva, è possibile ottenere un'architettura precisa delle isole con coordinate tridimensionali per ogni cellula dell'isola attraverso un metodo combinato di imaging 3D e mappatura manuale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello studio dell'obesità e del diabete, come ad esempio in che modo le condizioni fisiologiche e patologiche influenzano la distribuzione e l'architettura delle isole pancreatiche e la massa delle cellule beta.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi o terapia dell'obesità e del diabete Melitis, poiché una migliore comprensione dei cambiamenti nella massa delle cellule beta faciliterà lo sviluppo e la valutazione di interventi terapeutici. Sebbene i metodi descritti nel presente studio forniscano specificamente informazioni sull'analisi immunohistochemica dinamica del pancreas, essi possono essere applicati anche a una serie di altri organismi e tessuti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di analisi assistita da computer sono difficili da apprendere.

A causa della complessità nell'analizzare set di dati così ampi in due e tre dimensioni. Iniziare questa procedura posizionando un vetrino pulito contenente un'intera sezione di pancreas colorato istochimicamente e immunohisto su un portavetrini di un microscopio a fluorescenza. Aprire il software Stereo Investigator e visualizzare il campione cliccando su acquisizione.

E quindi immagine in diretta. Determinare i livelli di esposizione per ogni canale utilizzando la finestra dell'istogramma video, che mostra l'intensità della fluorescenza. In questo esempio, il canale due è utilizzato per DAP P, il canale tre per GFP, il canale quattro per RFP, il canale cinque per sci five e il canale sei per SCI seven.

Utilizzando la finestra delle impostazioni della fotocamera, regolare il livello di esposizione in modo che l'intensità della fluorescenza diminuisca. All'estremità destra dell'istogramma video, l'immagine può essere messa a fuoco mediante la manopola di messa a fuoco del microscopio. Prima di creare una sezione virtuale, delineare il campione facendo clic sullo schermo in un punto lontano dal campione, che fungerà da punto di riferimento.

Quindi fare clic attorno al contorno del campione quando il contorno è completo. Fare clic con il tasto destro e selezionare "chiudi contorno" per collegare i punti iniziale e finale; una volta chiuso il contorno, acquisire una sezione virtuale del campione selezionando acquisizione, quindi acquisisci sezione virtuale. Quando si aprono le opzioni della finestra della sezione virtuale, selezionare acquisizione ad alta velocità e disabilitare la modalità manuale.

Per eseguire la messa a fuoco, deselezionare la casella accanto a manuale. Salvare il file. Calibrare il prefo facendo clic con il tasto destro e selezionando aggiungi all'elenco dei siti di messa a fuoco.

Mettere a fuoco manualmente diverse sezioni casuali nell'anteprima della fetta virtuale. Una volta messe a fuoco diverse posizioni, avviare la fetta virtuale con un clic destro e selezionare. Avviare la fetta virtuale con prefo; al termine della fetta virtuale per il primo campione, passare al canale successivo e regolare l'esposizione di conseguenza. Questa procedura viene ripetuta per ogni canale al fine di eseguire la quantificazione degli occhielli. Elaborare le immagini utilizzando una macro di ImageJ denominata I-H-C-V-S, che in primo luogo prepara le immagini caricate per l'analisi e successivamente quantifica le caratteristiche degli occhielli, come la composizione cellulare.

I macro I-H-C-V-S suddividono lo stack nei relativi canali colore. In ImageJ converte ogni immagine in una maschera bianco e nero a otto bit. Dopo la sogliatura automatica dell'intensità, somma aritmeticamente le immagini dei canali separati in una maschera composita.

L'analisi integrata delle particelle di Image J sull'immagine composita identificherà quindi le regioni di interesse o ROI, escludendo al contempo particelle più piccole di una cellula beta. La quantificazione delle ROI. L'utilizzo di Image J produce un foglio elettronico contenente i parametri cellulari.

Salvare i risultati aggregati in un foglio di calcolo Excel. Archiviare i dati come area, perimetro, circularità, diametro fer, e centro dell'occhiello per ciascun occhiello, insieme ai numeri corrispondenti etichettati nell'immagine. L'analisi computazionale di questi parametri può essere eseguita come descritto nel protocollo scritto. Per ottenere informazioni quali distribuzione e analisi della frequenza degli occhielli, effettuare la ricostruzione 3D di fette virtuali eseguendo uno script che converte tutte le immagini JP2 nella directory in file TIF, formato utilizzato nella costruzione e nella quantificazione di stack tridimensionali derivati dalle fette virtuali.

Qui viene utilizzato uno script chiamato I MJ due due tiff. Copiare lo script nella directory che contiene le immagini JP due. Eseguire lo script con la shell Linux digitando punto barra I am JP due due TIFF nella console e poi premere invio.

Dopo aver convertito tutte le immagini acquisite da JP2 in file TIFF, queste sono pronte per essere utilizzate per l'analisi in ImageJ. Utilizzando ImageJ, aprire tutte le immagini del primo campione, che in questo caso provengono da un pancreas fetale umano, e unirle in un'unica immagine selezionando Immagine, Colore e quindi Unisci canali. Ripetere questo procedimento per ciascun campione. Una volta che tutti i campioni sono stati combinati in immagini singole, pulire le immagini selezionando le regioni indesiderate con lo strumento di selezione poligonale.

Compilare selezionando modifica e quindi riempimento. Convertire ogni immagine in un'immagine a colori RGB. Infine, creare una serie di immagini che potrà essere successivamente allineata utilizzando il plugin stack reg.

In definitiva, la fusione dei canali e la combinazione delle immagini creano un montaggio 3D di tutti gli isolotti pancreatici nell'intero pancreas. Per acquisire pile di immagini, posizionare gli isolotti pancreatici in preparato integrale sotto il microscopio. Applicare acqua se si utilizza un obiettivo a immersione in acqua.

Aprire il software dello slide book, accedere al controllo di acquisizione e messa a fuoco premendo contemporaneamente i tasti controllo, maiuscolo ed E nella finestra di controllo della messa a fuoco. Impostare l'obiettivo a 20 volte o 40 volte in base alle dimensioni dell'occhiello. Per utilizzare l'oculare del microscopio per individuare gli occhielli, impostare il bin a due volte e il set di filtri su utente uno.

Nella finestra di controllo del fuoco, la selezione dell'emissione deve essere impostata su 100%Eyes e la densità neutra deve essere regolata di un clic su GFP ey, quindi aprire il diaframma per visualizzare il campione nel libro delle diapositive. Tornare alla finestra di controllo del fuoco e commutare l'insieme di filtri su fisso. Quindi fare clic su G-F-P-D-S. Utilizzare il joystick per centrare il foro nella finestra della telecamera il più possibile.

Regolare il fuoco su una profondità prossima al centro dell'occhiello, dove le cellule possono essere facilmente discernibili. Nella finestra di controllo del fuoco, selezionare lo zab. Utilizzare il controllo del microscopio per scorrere fino alla profondità superiore dell'occhiello in cui le caratteristiche possono essere chiaramente discernibili e fare clic su imposta in alto.

Scorrere fino alla parte inferiore dell'occhiello e fare clic su imposta. Cliccare in basso per andare. Per tornare al punto di riferimento nella finestra di acquisizione, fare clic su avanzate e quindi su alternare alla modalità canale.

Impostare il fattore di binning su due e il tipo di acquisizione su 3D nella parte destra della finestra; fare clic su "usa posizioni superiore e inferiore" e tornare al volume centrale dopo l'acquisizione. Impostare l'incremento a tre. Impostare il set di filtri su "live" al di sotto della casella del set di filtri.

Selezionare DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U e SCI cinque DSU. Per ciascuno, fare clic su "trova il migliore" in regola esposizione. Quindi fare clic su prova per assicurarsi che l'esposizione selezionata sia adatta.

Fare clic su "start" per iniziare l'acquisizione. Al termine dell'acquisizione, regolare i livelli secondo necessità e modificare il colore visualizzato per RFP in bianco. Salvare la diapositiva e passare a visualizza esporta serie TIFF.

Digitare il nome del vetrino con un trattino alla fine e salvare. Vengono creati dozzine di file TIF individuali, quindi può essere utile mantenere ogni serie di immagini dei fori in una cartella separata. Per mappare le serie di immagini, aprire il software Stereo Investigator.

Visualizza l'immagine aprendo gli stack di immagini nel menu di ridimensionamento dell'immagine. Imposta la distanza tra le immagini a tre micron per correggere la curvatura doppia. Nel libro delle diapositive, seleziona l'opzione per ignorare la scala X e Y e utilizza un valore specificato come origine per la scala X e Y.

Inserire 0,65 sia per il centro X che per il centro Y e ingrandire l'immagine facendo clic sul pulsante di zoom, quindi al centro dell'ileo di interesse nella finestra macro evidenziare almeno una cellula. Utilizzando il marcatore appropriato, le cellule beta appariranno verdi. Le cellule alfa appariranno rosse e le cellule delta appariranno bianche.

Contrassegnare le cellule al centro del loro nucleo, che appariranno in blu se il campione è stato colorato con DPI; utilizzare il marcatore due per identificare le cellule beta. Il marcatore cinque per identificare le cellule alfa e il marcatore sei per identificare le cellule delta. Dopo aver contrassegnato almeno una cellula, visualizzare la vista ortogonale utilizzando l'icona nel menu superiore, quindi selezionare il filtro Z e l'opzione simmetrico.

L'intervallo deve essere impostato a 15,00. Partendo dal livello Z 0,0, scorrere i fori utilizzando la rotellina del mouse e contrassegnare ogni cellula con il marcatore appropriato, segnando ogni cellula una sola volta al centro della sua profondità. Al termine della marcatura di ciascun livello Z, è possibile deselezionare la casella di controllo del filtro Z.

Questo mostrerà tutti i marcatori di tutti i livelli Z. Una volta contrassegnata ogni cellula, salvare il file come file DAT. Quindi andare a esporta tracciamento del file.

Salvare il tracciamento come file TXT. Infine, fare clic su nuovo file di dati per pulire l'area di lavoro prima di tentare di mappare nuovi occhielli. La preparazione di sezioni virtuali ottenute da un campione di pancreas colorato mediante immunohistochemia permette l'esame delle cellule endocrine alfa, beta e delta in tutto il pancreas, insieme agli isolotti; la colorazione immunohistochemica per insulina appare in verde, glucagone in rosso, somatostatina in bianco e dap in blu.

Le immagini sono quindi state convertite in una maschera a otto bit dopo la sogliatura automatica. Qui viene mostrata l'immagine composita fusa. Tuttavia, la distribuzione degli occhielli mediante fetta virtuale consente anche un'analisi individuale in canali separati.

Qui, le immagini di ogni canale mostrano le cellule delta, le cellule beta e le cellule alfa. L'analisi delle particelle viene eseguita sulla maschera composita, in cui ogni struttura a occhiello è numerata ed evidenziata in blu. L'analisi delle particelle delle maschere composite viene prodotta come tabella di dati contenente parametri quali area, perimetro, circularità e diversi diametri per ciascun occhiello rilevato, ai quali corrispondono identificatori (ID) associati ai numeri riportati sulla maschera composita.

L'analisi su larga scala di queste immagini produce istogrammi del numero totale di islotti e della distribuzione delle dimensioni, oltre a confronti dettagliati delle aree delle cellule alfa, beta e delta. La mappatura degli islotti e l'analisi matematica della composizione cellulare e dell'architettura possono rivelare un singolo piano focale ottenuto da uno stack di immagini ricostruito in 3D di islotti umani caricati nel software Stereo Investigator. In questo caso, le cellule beta sono in verde, le cellule alfa in rosso, le cellule delta in bianco e i nuclei in blu.

Dopo il rilevamento di diversi occhielli, le cellule alfa, beta e delta vengono marcate a diversi piani marini qui, vengono mostrate immagini fluorescenti e i dati delle mappe corrispondenti per tre piani focali diversi a un intervallo di 10 micrometri. Una volta che le cellule alfa, beta e delta sono state marcate a diversi piani, l'occhiello può essere visualizzato in 3D. Qui viene mostrata una ricostruzione in 3D dell'occhiello tagliato a un quarto basata sulle coordinate ottenute mediante la mappatura dell'occhiello.

Inoltre, un'analisi matematica automatizzata degli occhielli mappati può mostrare la composizione cellulare e l'architettura. Qui viene mostrata la frequenza relativa delle distanze tra cellule all'interno di una singola popolazione cellulare. È inoltre mostrata la frequenza relativa delle distanze tra cellule appartenenti a due popolazioni cellulari diverse.

Sono inoltre mostrate le probabilità cumulative delle distribuzioni delle distanze tra cellula e cellula per le cellule alfa verso alfa, beta verso beta e delta verso delta. Il test di Kolmogorov-Smirnov (KS) può essere eseguito su queste probabilità per ottenere le corrispondenti distanze KS. Una volta acquisita padronanza, l'acquisizione e l'analisi su larga scala di un'intera sezione di tessuto possono essere completate in quattro ore.

La ricostruzione tridimensionale di un blocco di tessuto può essere eseguita in 30 minuti. Infine, l'acquisizione di immagini tridimensionali e la mappatura manuale possono essere completate in quattro ore se effettuate correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante iniziare con una colorazione immunohistochimica di alta qualità delle sezioni.

L'accuratezza dell'analisi successiva dipenderà interamente dai dati grezzi. Inoltre, assicurarsi che i computer dispongano di almeno otto gigabyte di RAM per elaborare analisi su tale scala dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, non solo nel campo dell'obesità e del diabete, ma ampiamente in molti altri settori che utilizzano l'analisi patologica standard.

Potrebbe essere particolarmente utile quando la disponibilità di campioni è limitata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere dati rappresentativi e privi di bias all'interno di un campione di dimensioni limitate, utilizzando tecniche standard. La selezione di una sola regione specifica potrebbe non essere rappresentativa dell'intera situazione, come abbiamo dimostrato mediante il nostro studio sulla distribuzione delle insule pancreatiche.