RNA interferenza nelle zecche

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la tecnica di interferenza dell'RNA nei tick mediante iniezione. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando un RNA a doppio filamento del gene o dei geni di interesse. L'RNA viene quindi iniettato nei tick, che successivamente vengono mantenuti in una camera umidificata per 24 ore.

Dopo questo periodo di attesa, ai tick viene consentito di nutrirsi su un animale come una pecora. Vengono determinati parametri legati all'alimentazione, come il peso, la muta e la posizione delle uova, nonché l'espressione del gene o dei geni bersaglio mediante R-T-P-C-R in tempo reale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano l'effetto del silenziamento dei geni bersaglio sulla biologia del tick, valutando i parametri biologici del tick e l'espressione genica mediante R-T-P-C-R in tempo reale.

Il nostro gruppo lavora con le zecche, cercando di caratterizzare gli eventi molecolari all'interfaccia zecca-patogeno, al fine di utilizzare queste informazioni di base per sviluppare metodi di controllo dell'infestazione da zecche e della trasmissione di patogeni a esseri umani e animali. L'interferenza dell'RNA si è affermata come uno strumento essenziale in questa ricerca, poiché è l'unico metodo disponibile per la manipolazione genetica delle zecche. La funzione di molti geni delle zecche è sconosciuta.

L'interferenza dell'RNA consente di definire il ruolo dei geni e dell'espressione genica nelle zecche in molti aspetti della loro biologia, tra cui accoppiamento, riproduzione, alimentazione, digestione, funzione delle ghiandole salivari e capacità delle zecche di trasmettere agenti patogeni. A dimostrare il procedimento sarà il gruppo di interferenza dell'RNA sulle zecche del nostro laboratorio, il dottor Ed Lewin, lo studente laureando Busby e io stesso. Per generare RNA a doppio filamento, sintetizzare innanzitutto primer oligonucleotidici contenenti sequenze del promotore T7 per la trascrizione in vitro dell'RNA.

Ad esempio, la lesione varia nel centro del derma. Utilizzare i primer oligonucleotidici D eight A a T 75 e D eight DVT 73 mostrati qui. Amplificare il gene bersaglio mediante R-T-P-C-R utilizzando 10 picomoli di ciascun primer oligonucleotidico e da 1 a 10 nanogrammi di RNA totale di zecca.

Successivamente, purificare il prodotto PCR. Quindi utilizzare otto microlitri o circa 100 nanogrammi per sintetizzare RNA a doppio filamento. Per preparare le zecche per l'iniezione, lavare innanzitutto le zecche nella seguente serie di soluzioni: acqua del rubinetto, perossido di idrogeno al 3%, acqua distillata due volte, etanolo al 70% e due lavaggi finali con acqua distillata.

Eseguire ogni lavaggio in un tubo da centrifuga monouso da 50 millilitri agitando, quindi decantare la soluzione attraverso un setaccio in filo metallico a maglia fine. Lasciare asciugare gli zecchi su carta assorbente, quindi aliquotare gli zecchi in gruppi di 20-50 in base all'esperimento.

Posizionare ogni gruppo in un bicchierino di plastica da 1,25 once con coperchio aderente ed etichettare ogni bicchierino con il gruppo sperimentale. Successivamente, formare un team per l'RNAi composto da tre persone che eseguiranno il processo di iniezione. La prima persona posiziona ogni zecca su un nastro adesivo doppio applicato su un foglio di cera rossa per odontotecnici di dimensioni 7,6 × 15,2 cm.

La seconda persona inietta le zecche e la terza monitora le zecche dopo l'iniezione, soffiando anidride carbonica sulle zecche per attivarle e contando e trasferendo le zecche vive in contenitori etichettati con il numero del gruppo sperimentale. Tutti i membri del team devono indossare guanti monouso. Per iniziare il processo di iniezione delle zecche, catturare una zecca utilizzando pinzette fini di Dumont e posizionarla con il lato ventrale rivolto verso l'alto su nastro adesivo doppio applicato su un foglio di cera rossa per odontotecnici. Posizionare le zecche in gruppi di cinque. Applicare una piccola striscia di nastro adesivo sulle parti boccali di tutte e cinque le zecche.

Per limitarne ulteriormente i movimenti, lasciare esposta la maggior parte del corpo in modo che l'iniettore possa osservare il processo di iniezione. Per iniettare la zecca, praticare un foro nel quadrante inferiore destro della superficie ventrale dell'esoscheletro utilizzando una siringa per insulina mono-eject dotata di ago da 29 gauge e mezzo pollice. Successivamente, iniettare immediatamente nelle zecche da 0,2 a 0,5 microlitri di soluzione di RNA a doppio filamento mediante una siringa Hamilton su misura e un ago da 33 gauge e un pollice con punta smussata a 45 gradi, inserendo bene l'ago nella cavità della zecca per assicurare il posizionamento e il mantenimento dell'RNA a doppio filamento.

Anche se il liquido viene rilasciato dopo l'iniezione, il posizionamento profondo dell'ago garantisce che una quantità sufficiente di RNA a doppio filamento venga depositata nella cavità della zecca per indurre il silenziamento genico; si deve fare attenzione a non iniettare in eccesso. Iniettare le zecche, poiché ciò provocherebbe la perdita di emolinfa e la morte della zecca stessa. Immediatamente dopo l'iniezione, prelevare le zecche dal nastro adesivo doppio con pinzette fini e collocarle in un contenitore di recupero in plastica.

I segni di spunta rimarranno brevemente inattivi dopo l'iniezione, ma dovrebbero presto iniziare a muoversi all'interno della piastra. Attivare i segni di spunta soffiando anidride carbonica su di essi. Una volta che i segni di spunta si stanno muovendo e sono attivi, la ferita da iniezione si rimarginerà rapidamente e molto probabilmente sopravvivranno.

Contare le zecche in ciascun gruppo sperimentale e posizionare ogni gruppo in un bicchiere di plastica etichettato con un coperchio ben aderente. Sostituire eventuali zecche morte nel gruppo corrente prima di iniettare il gruppo sperimentale successivo. Pulire la siringa Hamilton prima di iniettare il gruppo sperimentale successivo riempiendola ed espellendo la soluzione con perossido di idrogeno fresco al 3%.

15 volte, seguito da 15 lavaggi con acqua sterile. Prestare attenzione a non piegare lo stantuffo della siringa Hamilton, altrimenti lo stantuffo non si muoverà in modo uniforme e non risponderà al tocco delicato richiesto per l'iniezione nelle zecche. Dopo l'iniezione, collocare le zecche in una camera con un contenitore riempito di acqua e solfato di potassio, che mantiene un'alta umidità e le zecche per un giorno.

Successivamente, posizionare singoli acari nelle celle di alimentazione incollate a un ovino e lasciarli alimentare insieme a un numero uguale di acari non iniettati, maschi o femmine, a seconda del sesso non iniettato. Raccogliere e rimuovere gli acari femmine dalla cella di alimentazione dopo che hanno completato l’alimentazione, per circa 10 giorni oppure quando le femmine di controllo si sono staccate dall’ospite. Incubare ogni gruppo di acari in una camera umidificata fino al completamento della deposizione delle uova. Valutare la deposizione delle uova per gruppo pesando la massa delle uova prodotta da tutti gli acari di un gruppo, al fine di valutare il fenotipo degli acari dopo l’alimentazione.

Determinare il numero di zecche sopravvissute e calcolare il peso delle zecche, nonché la posizione delle uova e la fertilità delle uova. A seconda del gene bersaglio e degli obiettivi dello studio, possono essere eseguite altre analisi per confermare il silenziamento genico mediante R-T-P-C-R. Dopo l'alimentazione, dissezionare le ghiandole salivari e gli intestini da singole zecche appartenenti ai gruppi controllo iniettato e iniettato con R-N-A a doppio filamento, quindi estrarre l'R-N-A totale dai singoli campioni di tessuto.

Analizzare i trascritti del gene bersaglio in singoli tessuti mediante R-T-P-C-R in tempo reale e normalizzare i livelli di RNA rispetto all'RNA ribosomiale 16 s della zecca. Utilizzando il metodo gene norm, eseguire curve di dissociazione alla fine della reazione per assicurare che venga formato un solo amplicone e che gli ampliconi si denaturino in modo costante nello stesso intervallo di temperatura per ogni campione; confrontare i valori di CT normalizzati per i livelli di mRNA tra le zecche iniettate con controllo e quelle iniettate con RNA a doppio filamento utilizzando il test T di Student.

Il protocollo descritto qui è stato utilizzato nel nostro laboratorio per l'RNAi in numerose specie diverse di zecche esotiche. La quantità di RNA a doppio filamento iniettata nelle zecche varia in base alle dimensioni della zecca. Le specie di zecche più grandi possono accogliere un volume maggiore.

I riferimenti possono essere trovati nella sezione scritta allegata al protocollo. Se il protocollo viene eseguito correttamente, meno del 5% di mortalità dovrebbe essere osservato a seguito della procedura di iniezione dopo 24 ore. Viene mostrato qui un fenotipo tipico dopo l'abbattimento genico nelle zecche, in cui un gruppo di zecche è stato iniettato con miscele di RNA a doppio filamento utilizzate per lo screening di antigeni protettivi per le zecche.

In zecche esaminate mediante microscopia ottica, può essere osservata una degenerazione cellulare nei tessuti delle zecche. I cambiamenti fenotipici possono essere accompagnati anche da perdita di funzione. Ad esempio, l'RNAi di SUBIN produce maschi sterili che non possono accoppiarsi con successo con le femmine dopo l'interferenza dell'RNA e le zecche.

Altri metodi possono essere utilizzati per determinare l'impatto del silenziamento genico sull'espressione genica e proteica e sulla biologia delle zecche, inclusi R-T-P-C-R in tempo reale, microscopia ottica, elettronica o confocale. Genomica o proteomica. L'interferenza dell'RNA può essere eseguita anche in colture cellulari di zecche e fornisce un metodo in vitro per lo studio delle interazioni tra cellule delle zecche e patogeni.