Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una libreria di mutanti casuali per una specifica sequenza di DNA bersaglio e identificare rapidamente e caratterizzare i mutanti mediante una selezione funzionale semi-quantitativa. Questo viene ottenuto innanzitutto trasformando un plasmide con un'origine di replicazione contenente la sequenza bersaglio in un ceppo mutatore di coli. Dopo aver effettuato la semina e incubato le cellule per tutta la notte, queste vengono raccolte ed il plasmide bersaglio viene isolato per ottenere la libreria di mutanti; successivamente, la libreria di mutanti viene trasformata in un ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni nella seconda parte del protocollo. Viene costruita una piastra di crescita a gradiente e colture batteriche del ceppo di lettura vengono inoculate in una piastra Petri separata contenente agar morbido.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'improntare e trasferire queste colture batteriche sul gradiente. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nel profilo fenotipico di una sequenza bersaglio specifica attraverso differenze nella crescita su un gradiente di farmaco. Questo video presenta un metodo per l'evoluzione diretta di proteine in e coli.

Questo processo imita l'evoluzione naturale nella generazione di librerie casuali di nutrienti, seguita da una selezione che limita tale diversità. In questo modo, migliora la nostra capacità di generare nuove attività biochimiche per scopi industriali o biomedici. Questa procedura comprende due componenti: la generazione di una libreria casuale di mutanti e la selezione funzionale per ottenere mutazioni con acquisizione di funzione. A dimostrare questa procedura sarà Jennifer Allen, una tecnica del mio laboratorio.

Prima dell'inizio di questo protocollo, si considerino cellule elettrocompetenti JS200 che esprimono una variante a bassa fedeltà della DNA polimerasi uno o polimerasi a bassa fedeltà, una che era stata precedentemente preparata come descritto nel protocollo scritto; queste cellule contengono un allele termosensibile di pol uno, tale che l'attività della polimerasi a bassa fedeltà predomini a 37 gradi Celsius. Si costruisca un plasmide bersaglio contenente un'origine di replicazione di coli uno con la sequenza bersaglio clonata adiacente all'origine di replicazione. La polimerasi a bassa fedeltà uno inizia la replicazione del plasmide di coli uno, introducendo così mutazioni per avviare la mutagenesi.

Combinare 40 microlitri di cellule elettrocompetenti e da 30 a 250 nanogrammi di DNA plasmidico bersaglio in un interstizio di due millimetri. Sottoporre la miscela a un impulso di elettroporazione nell’elettroporatore a 1800 volt. Verificare la costante di tempo (TC) per garantire condizioni uniformi di elettroporazione per ogni campione.

Il TC idealmente corrisponde a cinque-sei millisecondi. Lasciare riposare la miscela di DNA cellulare in un millilitro di brodo LB per 40 minuti a 37 gradi Celsius, agitando a 250 giri al minuto. Preparare una piastra di Petri LV da 100 millimetri, preriscaldata a 37 gradi Celsius, contenente gli antibiotici appropriati per la selezione di entrambi i plasmidi; piastrare le cellule rigenerate a un'opportuna diluizione per ottenere una concentrazione quasi uniforme (lawn), definita come un numero distinto ma non quantificabile di colonie, come mostrato in questo esempio.

Dopo un'incubazione notturna, raccogliere le colonie batteriche delle piastre di Petri con brodo LB. Isolare il plasmide, il DNA dalle cellule raccolte e il plasmide risultante. Il DNA costituisce la libreria di mutanti casuali.

Eseguire un digestione con enzimi di restrizione tagliando la libreria di plasmidi con un enzima di restrizione che linearizza sia il plasmide bersaglio che il plasmide palo. Eseguire un gel analitico ARO sul DNA plasmidico isolato per confermare qualità e quantità. Una volta verificati i plasmidi, digerire un microgrammo della libreria con un enzima di restrizione che linearizza il plasmide palo, ma non taglia il plasmide bersaglio.

Al termine della digestione con enzimi di restrizione, purificare la libreria utilizzando un kit di purificazione del DNA. Infine, trasformare la libreria purificata in una ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni. Per iniziare la preparazione del gradiente, segnare 10 corsie equidistanti lungo un bordo della base della piastra di Petri quadrata.

Posizionare la piastra in inclinazione in modo che il bordo inferiore marcato sia sollevato di sette millimetri. Versare 25 millilitri di agar LB tiepido, mescolato accuratamente con una concentrazione appropriata dell'agente selettivo, nella piastra inclinata. Questo costituisce lo strato inferiore del gradiente.

Assicurarsi che l'agar LB ricopra la piastra in modo che l'estremità rialzata e contrassegnata contenga circa un millimetro di agar LB, mentre la parte abbassata ne contenga circa otto millimetri. Coprire la piastra con il coperchio KU per garantire la ventilazione e lasciare solidificare l'agar per 10-15 minuti. Una volta che lo strato inferiore di agar LB si è indurito, spostare la piastra su una superficie piana.

Successivamente, versare 25 millilitri di agar LB tiepido senza l'agente selettivo per ricoprire il primo strato di agar, assicurandosi di coprire completamente lo strato inferiore. Coprire la piastra con il coperchio KU per garantire ventilazione, quindi lasciare solidificare l'agar per 10-15 minuti prima di eseguire il trasferimento mediante stampaggio dei batteri. Per prima cosa, ottenere colture batteriche del ceppo indicatore e diluirle in modo da ottenere densità cellulari identiche, con una densità ottica a 600 nanometri inferiore a 1,0.

Successivamente, trasferire due millilitri di agar molle liquido equilibrato a 42 gradi Celsius sul fondo di una piastra di Petri rotonda da 100 millimetri, pipettare 40 microlitri della coltura batterica nell'agar molle e quindi mescolare agitando delicatamente la piastra. Rivestire il bordo lungo del vetrino microscopico con la miscela di agar molle. Quindi allineare il bordo rivestito del vetrino con il segno inferiore sulla piastra graduata.

Toccare la lametta alla superficie dell'agar. Un contatto leggero è sufficiente per trasferire una striscia dell'agar morbido sulla superficie del gradiente. La lametta viene quindi messa da parte per essere pulita e riutilizzata.

Ripetere questo processo. I campioni rimanenti e i controlli sperimentali devono essere inclusi in ogni piastra con gradiente. Se si eseguono più gradienti, incubare la piastra con il coperchio rivolto verso il basso tutta la notte a 37 gradi Celsius; i tempi e le temperature di incubazione possono variare a seconda dei ceppi batterici utilizzati per il saggio, ma un'incubazione tutta la notte a 37 gradi Celsius è generalmente sufficiente per ottenere una crescita visibile.

Infine, acquisire e analizzare la crescita cellulare come descritto nel protocollo scritto. Qui sono mostrate immagini di una ceppa indicatore trasformata con P-G-F-U-V non mutato o con una libreria mutante di PG FPUV, sottoposte a quattro cicli di mutagenesi. Colonie scure o debolmente fluorescenti indicano plasmidi contenenti mutazioni inattivanti per GFP.

Questa figura rappresenta la frequenza di mutazioni lungo tutta la sequenza neutra del plasmide bersaglio a intervalli di 100 paia di basi. Si noti che le mutazioni si verificano lungo l'intera sequenza del plasmide, ma con la frequenza più alta nelle regioni più vicine all'origine di replicazione. Qui, la crescita dei mutanti è mostrata in presenza di un gradiente di farmaco.

La distanza percorsa verso la sommità del gradiente indica un profilo differenziale di resistenza al farmaco tra i mutanti. In questo esempio, librerie di plasmidi della demetilasi ossidativa umana ABH due sono state analizzate per identificare mutanti con resistenza aumentata al metil metansolfonato, utilizzando gradienti di selezione farmacologica. Due. Tali librerie, rappresentanti due e quattro iterazioni del protocollo di mutagenesi, sono mostrate in confronto con il tipo selvatico parentale e il vettore vuoto.

La linea bianca indica la soglia al di sopra della quale sono state isolate colonie mutanti singole. Per ulteriori analisi fenotipiche, i mutanti della beta-lattamasi, R 1 64 H ed E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, precedentemente identificati mediante mutagenesi con bassa fedeltà P one e selezione astri e m, sono mostrati su un gradiente di 0,4 microgrammi per millilitro e di quattro microgrammi per millilitro. La protezione contro la cefotaxime è indicativa di un'attività di beta-lattamasi a spettro esteso.

Si noti che l'enzima beta-lattamasi di tipo selvatico non conferisce alcuna protezione rispetto alle cellule che esprimono un vettore vuoto. Pertanto, questi mutanti rappresentano un adattamento o l'evoluzione di una nuova attività biochimica. In questo studio abbiamo presentato una potente combinazione di mutagenesi e selezione funzionale per generare nuove attività biochimiche.

Una selezione funzionale può essere ottenuta attraverso la selezione farmacologica o mediante complementazione genetica, sfruttando la nostra capacità di generare una grande diversità genetica. La patogenesi potrebbe dover essere limitata a una sequenza specifica al fine di ottimizzare attività proteiche preesistenti o per una patogenesi mirata a un sito specifico. Questo può essere facilmente realizzato mediante clonazione.

Inoltre, la mutagenesi può essere dissociata da una selezione funzionale al fine di ottenere attacchi specifici o impronte mutazionali.