Lievito Colony metodo di inserimento
22 marzo 2011
Un metodo per l'integrazione di colonie di lievito che permette di sezionamento per la microscopia ottica ed elettronica. Questo protocollo consente di determinare la distribuzione delle cellule sporigeni e cellule pseudohyphal all'interno di colonie disposizione un nuovo strumento per comprendere l'organizzazione di tipi di cellule all'interno di una comunità fungine.
L'obiettivo generale di questa procedura è incorporare colonie di lievito. Questo viene ottenuto prelevando innanzitutto una colonia insieme all'agar sottostante da una piastra in agar, posizionandola su alcune gocce di agar fuso e ricoprendola rapidamente con ulteriore agar fuso. Successivamente, l'eccesso di agar viene tagliato via dalla colonia per ridurne le dimensioni in modo che possa adattarsi all'interno di uno stampo.
La colonia con AER incorporata viene quindi fissata, colorata, disidratata e infine infiltrata con resina spurs. Il blocco viene quindi posizionato in uno stampo con resina spurs aggiuntiva e incubato fino a indurimento, quindi sezionato. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano la distribuzione dei tipi cellulari all'interno di una colonia di lievito mediante microscopia ottica o elettronica.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica a scansione, è che consente di determinare la struttura interna della colonia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo microbico, come la distribuzione dei tipi cellulari all'interno delle colonie. Questo metodo ha fornito informazioni sulla struttura delle colonie di croce CAC, ma è probabile che possa essere applicato anche ad altri microrganismi.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la manipolazione e l'inclusione delle colonie potrebbe risultare difficile da apprendere solo da un protocollo scritto. L'idea per questo metodo è stata ispirata da alcuni dati genetici da noi pubblicati nel 2002, che suggerivano come le spore non fossero distribuite in modo uniforme all'interno delle colonie. Abbiamo adattato un metodo per la sezione delle colonie sviluppato da engelberg nel laboratorio di fin.
Cominciamo. Incubare il lievito Wild S visi su piastre con auger a 30 gradi fino a quando saranno presenti circa 300 colonie. Utilizzando una spatola stretta, rimuovere le colonie di diametro compreso tra uno e due millimetri, una alla volta dalla piastra.
Quindi, utilizzando una punta da pipetta da un millilitro, posizionare alcune gocce di agar al 2% a 42 gradi Celsius su un vetrino da microscopio e immediatamente posizionare la colonia sull'agar con la faccia verso l'alto, prima che l'agar si solidifichi. Aggiungere altre gocce di agar sulla colonia e lasciare solidificare l'agar, assicurandosi che l'intera colonia, compresa la parte superiore, sia completamente racchiusa nell'agar. In tutti i passaggi successivi del protocollo, utilizzare una lametta da rasoio.
Tagliare l'AER intorno alla colonia e posizionare il blocco di AER contenente la colonia. In una provetta in vetro borosilicato da 3,5 millilitri con tappo a vite contenente un fissativo di paraformaldeide al 2% e glutaraldeide al 2%, le colonie devono essere processate una alla volta per evitare l'essiccazione, ma fino a 10 colonie possono essere collocate nella stessa provetta. Lasciare le colonie per sette giorni a quattro gradi Celsius.
Dopo una settimana, rimuovere il fissativo e lavare due volte le colonie di agri utilizzando circa 1,5 millilitri di sodio 0,15 molare. Cate a pH 7,2 e incubare sul ghiaccio dopo ogni lavaggio per 15 minuti senza agitazione. Successivamente, eseguire altri due lavaggi.
Utilizzando 1,5 millilitri di un tampone X OS, composto da fosfato mono-potassico 100 millimolari, cloruro di magnesio 10 millimolari a pH 6,0, incubare in ghiaccio per cinque minuti dopo ogni lavaggio. Successivamente, utilizzando lo stesso vial, eseguire il trattamento con osmio e i lavaggi indicati qui e nella parte scritta di questo protocollo. Quindi, ancora utilizzando lo stesso vial, eseguire le deidratazioni progressive elencate qui e nel protocollo scritto allegato la mattina successiva.
Preparare il reagente spurs come indicato qui e nel protocollo scritto allegato. Lavare immediatamente i blocchi di agri cinque volte per 10 minuti ciascuno con 1,5 millilitri di etanolo al 100% a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio con etanolo, rimuovere solo una quantità sufficiente di etanolo in modo che il blocco di agri rimanga coperto.
Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere circa 0,5 millilitri di reagente Spurs nel vial e ruotare su una ruota a bassa velocità per 15 minuti. A temperatura ambiente dopo la rotazione, lasciare in riposo il vial per 30 minuti. Successivamente, rimuovere completamente la soluzione.
Quindi aggiungere 1,5 millilitri di reagente spurs per coprire il blocco agri. Ruotare nuovamente il flacone su una ruota per 15 minuti a temperatura ambiente e lasciare in riposo per 30 minuti. Ripetere questo lavaggio.
Ripetere il passaggio altre tre volte. Dopo i 30 minuti finali, rimuovere il reagente spurs e aggiungere reagente spurs fresco per coprire i blocchi. Lasciare i blocchi di agarosio a temperatura ambiente per quattro ore.
Sostituire il reagente spurs e ruotare durante la notte. La mattina seguente, sostituire il reagente spurs e lasciare i vialli in rotazione fino al giorno successivo. La mattina successiva, versare il reagente spurs negli stampi di silicone numerati in modo da coprire appena il fondo degli stampi.
Successivamente, posizionare i blocchi di agar nel modulo e incubare a 60 gradi Celsius per quattro ore. Dopo quattro ore, completare i moduli con ulteriori spruzzate di reagente e incubare a 60 gradi Celsius tutta la notte. Rimuovere i blocchi dal modulo per la sezionatura.
Qui è mostrato un esempio di microfotografia in luce di una sezione al centro di una colonia di lievito Wild S Visia. Questo lievito è un ceppo di tipo selvatico isolato da essudati vegetali. La colonia è stata incubata per sei giorni su mezzo YNA prima della sezionatura.
In questa immagine, gli asai, gli ipfi pseudofififormi e i lieviti ovali sono facilmente distinguibili e risulta evidente anche la regione della colonia che invade l'agar sottostante. Le frecce aperte indicano asai rappresentativi, le frecce piene indicano cellule vegetative ovali rappresentative, la punta di freccia piena indica catene di cellule allungate e si. Questa immagine è un esempio di micrografia elettronica di una sezione sottile di un ceppo di laboratorio di lievito SH 1 0 2 0 e W 3 0 3.Background.
La colonia è stata incubata per sei giorni su mezzo YNA prima della sezionatura. L'immagine mostra una regione della colonia contenente una frequenza elevata di cellule sporulate. Una freccia indica la struttura a doppio strato della parete dello sporofito.
Nella parte A, mostriamo una sezione di una colonia di quattro giorni con una griglia composta da 15 rettangoli sovrapposti all'immagine nella parte B. La frequenza di cellule associate alle spore in ciascun rettangolo è riportata con 15 barre corrispondenti ai 15 rettangoli mostrati nella parte A. I dati rappresentano la media e l'errore standard di quattro colonie indipendenti di quattro giorni. Nella parte C, sono mostrate le medie e gli errori standard di quattro colonie indipendenti di otto giorni. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due settimane con un giorno intero e diversi giorni di durata da una a tre ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere immediatamente le soluzioni in modo che i blocchi non si secchino dopo aver seguito questa procedura.
Altri metodi, come la microscopia elettronica immunoistochimica, potrebbero essere utilizzati per determinare la distribuzione delle cellule che esprimono proteine specifiche dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ci ha permesso di osservare non solo il modello di disposizione delle cellule sporulate, ma anche quello delle cellule pseudofungine nelle colonie croce CCI. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come incorporare colonie di lievito per la sezionatura.
Non dimenticare che molti dei reagenti per microscopia utilizzati in questo protocollo possono essere estremamente pericolosi. Ricorda di usare una cappa aspirante, indossare abbigliamento protettivo e smaltire correttamente i reagenti. Bene, questo è tutto.
Grazie per aver guardato. Buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'inclusione di colonie di lievito, che permette il sezionamento per microscopia ottica ed elettronica. Il protocollo facilita l'analisi di cellule sporulate e cellule pseudofillamentose all'interno delle colonie, contribuendo alla comprensione dell'organizzazione dei tipi cellulari nelle comunità fungine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Biologia fungina
Sfondo
- Le colonie di lieviti presentano diversi tipi cellulari.
- Comprendere la distribuzione delle cellule è fondamentale per lo studio delle comunità fungine.
- I metodi tradizionali potrebbero non fornire informazioni dettagliate sull'organizzazione cellulare.
- Questo metodo offre un nuovo approccio per la visualizzazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'inclusione di colonie di lievito.
- Permettere un'analisi dettagliata della distribuzione dei tipi cellulari.
- Migliorare la comprensione dell'organizzazione delle comunità fungine.
Metodi Utilizzati
- Rimozione di colonie di lievito da piastre in agar.
- Inclusione delle colonie in agar fuso.
- Taglio dell'agar in eccesso per adattarlo agli stampi.
- Fissazione, colorazione, disidratazione e infiltrazione con resina.
Risultati principali
- Incorporamento riuscito di colonie di lievito per la microscopia.
- Visualizzazione di cellule sporulate e cellule pseudofillamentose.
- Analisi dettagliata della distribuzione dei tipi cellulari all'interno delle colonie.
- Nuove informazioni sull'organizzazione delle comunità fungine.
Conclusioni
- Il metodo di inclusione è efficace per l'analisi microscopica.
- Fornisce uno strumento prezioso per lo studio della struttura delle colonie di lievito.
- Le ricerche future possono basarsi su questo metodo per esplorare le interazioni fungine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere l'organizzazione spaziale dei tipi cellulari all'interno delle comunità microbiche supporta la validazione degli obiettivi nella scoperta di antimicrobici e antifungini. Questo metodo consente una riduzione del rischio meccanicistica rivelando l'eterogeneità fenotipica che potrebbe influenzare la risposta al farmaco e lo sviluppo della resistenza. Fornisce un'elevata affidabilità predittiva per lo screening in fase iniziale, collegando l'architettura della colonia a sottopopolazioni funzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della distribuzione di cellule sporulate e pseudofillamentose all'interno delle colonie.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso l'osservazione diretta del patterning dei tipi cellulari associato a stati funzionali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi preservando le relazioni spaziali tra i tipi cellulari.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso un sezionamento e un'immagine costanti delle strutture interne delle colonie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza della malattia attraverso la visualizzazione di regioni colonizzanti invasive che modellano la penetrazione microbica nei tessuti dell'ospite.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo la correlazione strutturale con gli esiti fenotipici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posiziona il metodo nella fase iniziale della scoperta, fino all'identificazione del capostipite, consentendo un fenotipaggio strutturale che orienta le decisioni di screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'immagine diretta della distribuzione asimmetrica delle cellule.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la produzione di sezioni spesse e sottili compatibili con microscopia ottica ed elettronica.
- Analisi: Evidenzia risultati quantitativi come la mappatura della frequenza delle cellule sporulate nelle diverse regioni della colonia, utile per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica associando i margini invasivi delle colonie a modelli di penetrazione nei tessuti.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per l'analisi strutturale in diverse ceppi fungini e condizioni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nel comportamento delle comunità microbiche.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della preparazione delle colonie per flussi di lavoro microscopici condivisi da più utenti.
- Valore strategico: Decisioni migliorate di avvio/cessazione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie a una riduzione precoce del rischio fenotipico.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su biomarcatori strutturali di virulenza o persistenza.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in istologia, microscopia e manipolazione di microrganismi.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microtomi, microscopi ottici ed elettronici e sistemi per l'infiltrazione delle resine.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi diversi per le procedure di fissazione, colorazione e sezionamento nei gruppi di microbiologia e di imaging.
- Considerazioni sull'adattamento a diversi sistemi modello, come batteri formatori di biofilm o altre specie di lieviti con morfologia coloniale variabile.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, incluse le dimensioni delle colonie (diametro di 1-2 mm) e i tempi di elaborazione che si estendono per più giorni, richiedenti tecniche sterili per prevenire contaminazioni.
