Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare lo stato funzionale dei mitocondri in cellule vive e mitocondri isolati misurando diversi parametri del metabolismo ossidativo mediante l'analizzatore del flusso extracellulare XF 96. Questi parametri sono la respirazione basale, il ricambio dell'ATP, la perdita protonica e la respirazione massima o la capacità respiratoria di riserva. Ciò si ottiene aggiungendo in sequenza specifici modulatori della respirazione mitocondriale a cellule mioblastiche C2C12 e misurando la variazione del tasso di consumo di ossigeno, o OCR, un indicatore della respirazione, e della conversione del glucosio in lattato, che genera ATP attraverso la glicolisi.

L'altro importante percorso metabolico nelle cellule viene misurato anche come ECAR, ovvero tasso di acidificazione extracellulare. È possibile ottenere profili mitocondriali che forniscono informazioni sul ruolo centrale svolto dalla funzione mitocondriale nella determinazione della durata della vita delle cellule. Ciao, mi chiamo David Nichols.

Sono stato un artista dei mitocondri per tutta la mia carriera e il dispositivo più importante che ho utilizzato nei miei studi è stato l'elettrodo per l'ossigeno. Se si riesce a misurare la velocità di assorbimento dell'ossigeno in diverse condizioni con mitocondri isolati, si ottiene un'informazione estremamente significativa. Quando si passa alle cellule, specialmente a cellule coltivate in una piastra multipozzetto o su un cover slip, i metodi classici non funzionano.

Questo è un problema importante, che è stato superato alcuni anni fa grazie allo sviluppo di un saggio in piastre multipozzetto che ci permette di studiare in parallelo la respirazione cellulare in un formato a piastre multipozzetto. Quello che vedrete oggi è un esperimento molto semplice ma ricco di informazioni, che abbiamo ideato per monitorare la funzione bioenergetica mitocondriale di base in cellule in coltura. Per iniziare, seminare le cellule in piastre per colture cellulari XF 96 con 10.000 cellule per pozzetto in 100 microlitri di mezzo di crescita e collocare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica.

Le cellule possono essere saggiate nel XF 96, 24 ore dopo la semina, utilizzando il saggio. L'assistente genera un modello con la seguente disposizione dei gruppi. Le colonne da uno a dodici contengono tutte 10.000 cellule C2C12.

Il gruppo uno in blu viene utilizzato come controllo cellulare. Al gruppo due in rosso verranno somministrati i farmaci oligo Micina, FCCP e roone. Successivamente, preparare i composti nel mezzo di saggio X-F-D-M-E-M come descritto nella parte scritta del protocollo.

Oligomicina, FCCP, rotenone. Questi composti sono pre-dispensati nel kit del test di stress mitocondriale XF. Utilizzando la stazione di preparazione XF, sostituire il mezzo di crescita con mezzo di esecuzione DMEM.

Infine, incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 60 minuti, in modo da permettere alle cellule di pre-equilibrarsi con il mezzo dell'assay prima di aggiungere i composti iniettabili nella cartuccia del sensore, riscaldando i composti a 37 gradi Celsius. Successivamente, caricarli nei porti dell'iniettore come segue. Per le colonne da uno a quattro, aggiungere 16, 18 e 20 microlitri di mezzo XF assay o DMEM rispettivamente nei porti A, B e C.

Per le colonne da cinque a dodici, caricare 16 microlitri di tutti i liga micina nella porta A, 18 microlitri di FCCP nella porta B e 20 microlitri di rot noto nella porta C. Successivamente, definire i comandi del protocollo: impostare il ciclo su tre volte. Mescolare per tre minuti e misurare per tre minuti. Quindi, fare clic su avvia.

Seguire le istruzioni sullo schermo che indicheranno all'utente quando caricare la cartuccia al termine della calibrazione. Seguire i messaggi guidati e aggiungere la piastra cellulare per l'esperimento. Quindi fare clic su continua e lasciare che il saggio proceda.

Rimuovere la piastra al termine dell'esperimento. Questo saggio deriva dall'esperimento classico per lo studio della funzione mitocondriale e costituisce una base su cui sviluppare esperimenti più complessi volti a comprendere gli effetti di diversi composti sul metabolismo cellulare, sulla funzione mitocondriale e sulle attività bioenergetiche complessive. In questo caso, abbiamo osservato la risposta attesa nel tasso di consumo di ossigeno man mano che le cellule venivano trattate con ciascun composto in successione.

Per la ligamicina, la quantità di ATP diminuisce a causa del blocco della sintesi di ATP nel complesso mitocondriale V. Poiché le cellule non erano in grado di sintetizzare ATP mediante fosforilazione ossidativa dopo il trattamento con ligamicina, sono ricorse alla glicolisi per soddisfare la loro richiesta di ATP. Di conseguenza, abbiamo osservato un aumento del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), un indicatore della glicolisi, come mostrato in precedenza. La FCCP agisce come agente disaccoppiante e rimuove il limite al reingresso dei protoni.

La respirazione accelera ed è ora limitata dal trasporto di elettroni. Infine, il rotenone inibisce il complesso I mitocondriale, causando l'arresto del flusso di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni e, di conseguenza, il consumo di ossigeno è drasticamente ridotto. In questo modo si ottengono informazioni sulla respirazione basale delle cellule, sulla percentuale di consumo di ossigeno destinata alla produzione di ATP, nonché sulla quantità impiegata per mantenere il gradiente protonico a causa della perdita di protoni.

Inoltre, possiamo ottenere la massima velocità respiratoria in condizioni di respirazione disaccoppiata, talvolta definita capacità respiratoria di riserva. E infine, possiamo determinare la quantità di consumo di ossigeno non attribuibile a processi mitocondriali. Avete appena visto con il Seahorse.

XF 96, una serie di esperimenti che fornisce un'enorme quantità di informazioni sulla bioenergetica mitocondriale nelle cellule. L'esperimento fondamentale, così importante da essere chiamato esperimento numero uno, fornisce dati sulla respirazione basale, sul ricambio dell'ATP, sulla perdita protonica mitocondriale e sulla capacità respiratoria di riserva. Questi parametri forniscono informazioni essenziali sullo stato bioenergetico dei mitocondri all'interno della cellula.