Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

L'obiettivo generale della seguente procedura è mostrare come la normalizzazione dell'architettura cellulare e della posizione, ottenuta su specifici microdisegni adesivi, permetta una facile automazione dell'acquisizione delle immagini e un'elaborazione semplice delle immagini con una quantificazione sensibile e robusta degli effetti dei farmaci, cosa irraggiungibile sui tradizionali supporti in vetro. Questo risultato si ottiene seminando cellule heli su chip SI due che presentano microdisegni a forma di L etichettati SI tre. Le cellule assumono una forma triangolare formando un fascio di stress principale che si estende tra le due estremità della L. Le cellule sui disegni vengono quindi incubate con lebos statin o lasciate non trattate, poi fissate e colorate per visualizzare il citoscheletro di actina e i nuclei.

Le immagini delle cellule micropattern sono quindi acquisite ed elaborate utilizzando la macro cell ref per generare uno stack di immagini da analizzare e la macro hypotenuse per quantificare i fenotipi. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano un effetto significativo di basse dosi di BLEs statina sulle cellule micropattern HELOC, effetto non rilevabile nelle condizioni standard di coltura cellulare. Ciao, benvenuto.

Siamo qui oggi per accompagnarvi attraverso il nostro protocollo sperimentale che spiega come utilizzare microdisegni adesivi per l'analisi cellulare, nonché per mostrarvi dati sperimentali che illustrano la semplice quantificazione di dosi molto basse di farmaci su questi microdisegni adesivi. Osservando per la prima volta questi microdisegni, comprenderete immediatamente come possano risolvere i problemi di variabilità nella cattura delle immagini durante l'analisi cellulare. Infatti, disponendo di un vero e proprio array di cellule, simile a un microarray, è possibile spostare facilmente lo stadio del microscopio da una cellula all'altra per acquisire immagini in modo progressivo.

Ma questo naturalmente non è l'unico vantaggio offerto dai microdisegni. Offre molti ulteriori miglioramenti perché, in effetti, su determinati microdisegni tipici come il crossbo o la Y, stiamo normalizzando l'architettura cellulare interna, il che significa che gli organelli, il fuso mitotico, il citoscheletro e le diverse reti proteiche si trovano tutti nella stessa posizione da cellula a cellula o nella stessa orientazione da cellula a cellula, rendendo così molto più semplice prevedere e quantificare gli effetti dei farmaci su questi particolari disegni. Ora questo può sembrare piuttosto controintuitivo rispetto a quanto normalmente si fa nella classica piastra di Petri o nella micropiastra.

Beh, perché si osserva spesso, ovviamente, che le cellule si muovono e assumono diverse morfologie. Mentre sui micropattern adesivi, tutte le cellule inizieranno ad apparire simili perché rispondono a questo micropattern adesivo e organizzano la loro architettura nello stesso modo. Questo potrebbe sembrare effettivamente un po' artificiale, ma osservando da vicino, non è forse ancora più artificiale la piastra di Petri?

Nei tessuti, le cellule sono vincolate dalle cellule adiacenti e dalla matrice extracellulare, pertanto ricevono molte informazioni spaziali che orientano l'architettura cellulare. Questa è la base all'uso di micropatterns, che è ciò che stiamo facendo.

Stiamo ripristinando queste informazioni spaziali alle cellule e tutte le cellule rispondono a questo stimolo organizzandosi nello stesso modo. Ora, poiché tutte le cellule sono simili tra loro, possiamo introdurre il concetto di cellula di riferimento, ovvero possiamo mediare tutte le immagini ottenendo un'immagine singola, che rappresenta fedelmente l'aspetto della cellula in una determinata condizione. Successivamente, è possibile aggiungere un farmaco e osservare nuovamente la cellula di riferimento per valutare come il farmaco abbia modificato la morfologia o l'organizzazione cellulare.

Posizionare due chip situ two singolarmente in due pozzetti indipendenti di una piastra a sei pozzetti, assicurandosi che il logo situ two sia leggibile. I chip situ two utilizzati per questo esperimento presentano microstrutture colorate con FibroGen SI three e devono essere conservati al buio prima dell'uso. Raccogliere le cellule hela che sono circa all'80% confluenti mediante tripsina e verificare che siano adeguatamente individualizzate al microscopio; centrifugare a 300 ×g per quattro minuti e risospendere delicatamente le cellule. Contare e diluire le cellule fino a una concentrazione di 15.000 cellule per millilitro.

Nel mezzo di coltura D-M-E-M-F 12 incompleto, distribuire 60.000 cellule per pozzetto. La piastra dovrebbe essere spostata il meno possibile per evitare di introdurre movimenti rotatori nel mezzo, che tenderebbero a concentrare le cellule al centro. Lasciare sedimentare le cellule per 10 minuti sotto la cappa, quindi trasferirle nell'incubatrice per cellule.

Dopo 10-20 minuti nell'incubatore cellulare, le cellule inizieranno ad aderire dopo 10 minuti; controllare regolarmente al microscopio quando le cellule si sono attaccate. Cambiare il mezzo cellulare ed eliminare l'eccesso di cellule ripetendo la seguente procedura quattro volte. Mantenendo la piastra in piano, aspirare delicatamente il mezzo dal lato del pozzetto.

Attenzione a mantenere un quantitativo sufficiente di mezzo per evitare che il chip si secchi. Aggiungere quattro millilitri di PBS ed aspirare a partire dal centro del chip. Successivamente, spostarsi ai lati del pozzetto per aspirare la maggior parte del PBS come in precedenza, quindi controllare al microscopio la presenza di cellule in sospensione.

Se rimane una grande quantità di cellule in sospensione, ripetere la procedura di lavaggio. Se sono presenti molto poche cellule, aspirare parte del PBS e sostituirlo con due millilitri di mezzo fresco, quindi aspirare nuovamente e aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco per due volte. Incubare le cellule per tre ore in un incubatore cellulare per consentire alle cellule di aderire completamente.

Utilizzando questo metodo, dal 10 al 30% dei microdisegni sarà occupato da una singola cellula, mentre altri disegni saranno o vuoti o occupati da più cellule. Per trattare le cellule con BLEs statina, diluire la soluzione madre del farmaco 17 millimolare a una concentrazione finale di cinque micromolari con 0,1% di DMSO in quattro millilitri di mezzo. Per il controllo, preparare il mezzo con solo 0,1% di DMSO, aspirare il mezzo cellulare e sostituirlo rapidamente con le soluzioni di BLEs statina o con quelle di controllo per evitare che il chip si secchi.

Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante questa incubazione, preparare il buffer del citoscheletro. Aggiungere un grammo di saccarosio a due millilitri di cb.

Questo aiuta a preservare le strutture cellulari interne. Mescolare un millilitro di saccarosio in CB con quattro millilitri di PFA al 5%. Aggiungere due millilitri di PFA nella soluzione di saccarosio in CB.

In due pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti. Per fissare le cellule, utilizzare pinze per prelevare il chip CY2 e posizionarlo nella piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di PFA in soluzione di saccarosio CB. Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il PFA e lavare le cellule una volta con PBS, quindi lavare le cellule con due millilitri di cloruro di ammonio 100 millimolare per 10 minuti.

Per bloccare l'attività residua di cross-linking del PFA, permeabilizzare le cellule aggiungendo due millilitri di PBS contenente 0,1% Triton X-100 per tre minuti, lavare due volte con PBS, quindi colorare i filamenti di actina con due millilitri di farina coniugata con ZI in un rapporto di 1 a 2000 in PBS con 1,5% di BSA, incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule una volta con due millilitri di PBS. Poi, mantenere i nuclei.

Aggiungere due millilitri di un milligrammo per millilitro di hawked in PBS e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con due millilitri di PBS. Montare i due chip laterali su un vetrino standard utilizzando da 25 a 30 microlitri di soluzioni di montaggio come al.

Per acquisire immagini in tre lunghezze d'onda, utilizziamo il software di imaging Metamorph e un microscopio NIK icon eclipse T, dotato di una fotocamera CCD Hema Matsu e di un illuminatore a fibra di mercurio Intens Lite. Selezionare innanzitutto un'ingrandimento di 20x.

Successivamente nella barra del menu, aprire l'acquisizione multidimensionale per impostare i diversi parametri dell'esperimento. Indicare innanzitutto dove salvare i dati.

Impostare il numero di lunghezze d'onda a tre, selezionare le tre lunghezze d'onda SI e posizionare il vetrino coprioggetto in modo che 12 micro pattern siano centrati nel campo visivo della telecamera. Il numero di micro pattern visualizzati per campo varierà a seconda delle configurazioni della telecamera e dell'obiettivo. Impostare il tempo di esposizione per ciascuna lunghezza d'onda e la messa a fuoco automatica.

Per PS tre, creare un journal per l'acquisizione multi-dimensionale e salvarlo come MDA jnl. Aprire la funzione di scansione della piastra per acquisire 24 immagini, ciascuna contenente 12 micro-pattern. Inserire sei colonne e quattro righe con dimensione del passo x pari a meno 400 micron e dimensione del passo y pari a 300 micron nell'insieme di journal da eseguire, caricare il journal MDA jnl e premere scan per avviare l'acquisizione automatizzata delle 24 immagini nelle tre lunghezze d'onda.

In questo video, i micro pattern di forma L vengono utilizzati per indurre la formazione di una singola fibra principale di actina da stress che sostiene la parte della cellula non aderente e semplifica la visualizzazione e la misurazione dell'impatto delle statine sulle cellule, rispetto alle cellule aderenti su fibronectina semplice. Per l'elaborazione e l'analisi automatizzata delle immagini, illustriamo due macro personalizzate scritte per il programma open source ImageJ: a partire da uno stack di immagini grezze, la prima macro estrae le singole cellule e crea una cellula di riferimento. La seconda macro misura il collasso della membrana cellulare.

Il primo passaggio consiste nella segmentazione delle singole cellule a partire da immagini grezze. Le immagini del micro pattern marcate con fluorescenza vengono utilizzate per delimitare le regioni centrate sui micro pattern, che vengono ritagliate nelle immagini per ogni lunghezza d'onda e quindi riassemblate in stack separati per ogni lunghezza d'onda. Per selezionare i micro pattern contenenti una singola cellula, il macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina, in tutti gli stack, quelle immagini che contengono più di un nucleo o nessun nucleo.

Infine, il plugin ImageJ multi-stack reg viene utilizzato per riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione del micromotivo. Questo passaggio genera pile di immagini individuali che possono ora essere utilizzate per l'analisi di singole cellule o per creare una cellula di riferimento. In ImageJ, la cellula di riferimento viene costruita creando una proiezione delle immagini filtrate e allineate provenienti da una pila.

Possono essere applicati diversi metodi di proiezione, ma di solito si sceglie una proiezione mediana per eliminare i valori anomali dello stack di immagini. La cellula di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e l'analisi delle immagini, ottenibile soltanto con cellule su micropattern. Per facilitarne l'esame, viene applicata una tabella di consultazione (LUT) per convertire l'immagine monocromatica in una mappa di frequenza codificata.

Per caratterizzare l'effetto dello statina sui BLE, la rigidità e il collasso della cellula sono stati analizzati utilizzando una seconda macro di ImageJ. In breve, le immagini soglia del micro-modello L vengono utilizzate per definire un'ipotenusa teorica della forma triangolare della cellula. Successivamente, viene eseguita la sogliatura delle immagini di marcatura dell'actina per definire la forma della cellula.

La differenza di area tra l'ipotenusa teorica e la membrana cellulare concava effettiva viene quindi misurata: le cellule che presentano un'area al di sotto dell'ipotenusa teorica sono considerate collassate. L'impatto dello statina BLEs a cinque micromolar è stato caratterizzato confrontando il numero di cellule collassate in condizioni trattate e di controllo. Sono mostrate immagini tipiche di cellule micropatternate di L trattate con lo statina BLEs o lasciate non trattate; le cellule sono state fissate e colorate sui micropattern.

L'actina e i nuclei sono mostrati rispettivamente in rosso, verde e blu. Si noti l'impatto dello statino BLEs sulla forma cellulare rispetto alle condizioni di controllo. Qui sono mostrate cellule rappresentative dopo incubazione con lo statino BLEs o con i controlli su fibronectina pura.

Le cellule sono state fissate e colorate; l'actina e i nuclei sono rispettivamente in verde e in blu. Si noti la somiglianza tra le condizioni trattate e quelle di controllo. Sono mostrate immagini tipiche di cellule di riferimento ottenute da cellule trattate con statine BLE o lasciate non trattate.

Si noti il potenziale di questo approccio per l'osservazione semplice del fenotipo in studio. Di seguito è riportato un esempio di analisi degli effetti dello statina BLEs sulle cellule mediante l'uso del macro ipotenusa. Mentre il 25% delle cellule di controllo era collassato, questa percentuale triplicava fino al 75% nelle cellule trattate con lo statina BLEs a cinque micromolar, indicando un'indebolimento della rete contrattile dell'actinina.

Dopo aver visto questo, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come le microstrutture adesive risolvano diverse criticità nell'analisi ad alto contenuto. In primo luogo, l'uso di microstrutture adesive ha reso molto più semplice l'acquisizione, l'elaborazione e l'analisi delle immagini. In secondo luogo, le microstrutture permettono di rilevare effetti estremamente sottili dei farmaci a dosi molto basse, poiché si riduce la variabilità tra cellula e cellula normalizzandone la morfologia e il comportamento.

E infine, rispetto alle migliaia di cellule che di solito sono necessarie per ottenere un buon risultato nell'analisi cellulare, sono necessarie solo poche decine di cellule per ottenere un risultato robusto e significativo utilizzando la nostra cellula di riferimento.