Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare il modello fisico corretto che descrive il legame tra una macromolecola e il suo ligando e determinare i relativi parametri termodinamici. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando una soluzione madre della macromolecola mediante dialisi prolungata. Il ligando di interesse viene quindi disciolto nel tampone finale di dialisi e le concentrazioni di tutti i componenti vengono determinate nel secondo passaggio.

I campioni di macromolecola e ligando vengono accuratamente diluiti a una serie di diverse concentrazioni. Successivamente, viene eseguita una serie di esperimenti di calorimetria di titolazione isoterma, o ITC, a diverse concentrazioni sia di ligando che di proteina, al fine di ottenere una serie di isoterme ITC nell'ultima fase della procedura. Viene effettuata un'analisi globale della serie di esperimenti utilizzando diversi modelli fisici e il modello che fornisce il miglior accordo complessivo viene identificato come corretto.

Oggi vi mostrerò un metodo che può aiutare a rispondere a domande di tipo biofisico, come ad esempio il modo in cui le molecole proteiche si legano ai loro ligandi, fornendo al contempo misure accurate di parametri di legame quali entropia, entalpia e costanti di associazione. Prima di iniziare questo protocollo, purificate la proteina di interesse. Il macromolecola utilizzata in questa dimostrazione è un'immunoglobulina glicosilata N sei prime, un trasferasi sottile uno I o una C sei prime uno I. Per cominciare, preparate quattro litri di tampone per la dialisi e raffreddatelo a quattro gradi Celsius. Successivamente, sottoponete a dialisi un piccolo volume di soluzione della macromolecola.

In questo caso, cinque millilitri di AAC C sei primi 400 micromolari, un occhio in 1,3 litri di tampone di dialisi a quattro gradi Celsius. Questa operazione può essere eseguita in una stanza fredda o in un refrigeratore, sostituendo il tampone con quello fresco ogni otto ore e procedendo con un totale di tre dialisi. Conservare la soluzione finale di dialisi.

Filtrare 750 millilitri della soluzione finale di dialisi attraverso un filtro in cellulosa da 0,45 micron e conservare a quattro gradi Celsius. Questo tampone, ora indicato come tampone di corsa, verrà utilizzato per i risciacqui e come diluente. Per i campioni, risciacquare accuratamente un filtro per siringa da 0,2 micron con il tampone di corsa.

Applicare il campione proteico e filtrare. Raccogliere delicatamente il campione in un tubo conico prima di conservare la soluzione proteica e determinare la concentrazione proteica mediante un saggio proteico standard. In questo caso, la concentrazione proteica viene misurata per ASSORBENZA a 280 nanometri e la concentrazione enzimatica viene calcolata.

Utilizzando un coefficiente di estinzione generato dal server proteomico EXI, conservare la proteina in modo da massimizzare la stabilità a lungo termine. AAC C sei prime uno occhio deve essere conservato a quattro gradi Celsius poiché non mantiene l'attività dopo il congelamento e lo scongelamento. Successivamente, sciogliere il ligando e il buffer di corsa. Per questa dimostrazione, quattro milligrammi di acetil coenzima A sono stati sciolti in 200 microlitri di buffer di corsa per ottenere una soluzione stock da 25 millimolari.

Questo ligando può essere conservato a meno 78 gradi Celsius fino al momento dell'uso per preparare i campioni per la calorimetria a titolazione isotermica (ITC). Per prima cosa, calcolare la concentrazione dell'enzima per ottenere un valore C di 64, come descritto nel protocollo scritto per AAC sei primi uno I. Ciò corrisponde a una concentrazione di 192 micromolare. Preparare una soluzione di due millilitri della macromolecola a questa concentrazione, diluendo la soluzione madre con il tampone di lavaggio filtrato FIA. Scongelare la soluzione di coenzima A acetilato in un bagno di ghiaccio e acqua. Una volta scongelata la soluzione di acetil-coenzima A, mescolare delicatamente e calcolare la concentrazione della soluzione del ligando moltiplicando la concentrazione della macromolecola per il numero di siti di legame moltiplicato per 10.

Preparare la soluzione di acetil co-enzima A aggiungendo 80 microlitri della soluzione madre di acetil co-enzima A 25 millimolare a 420 microlitri di buffer di corsa e mescolando. Trasferire la soluzione diluita di acetil co-enzima A in un tubo di riempimento della pipetta e riporre la soluzione madre rimanente 25 millimolare a meno 78 gradi Celsius per la conservazione. Depurare le soluzioni di a C sei primi uno occhio e di co-enzima A sotto vuoto per cinque minuti a 19 gradi Celsius, ovvero un grado Celsius al di sotto della temperatura desiderata per l'esperimento.

Per preparare la siringa per l'iniezione, inserire la siringa in un supporto per siringhe fino a quando la pinza per siringa premontata si trova alla stessa altezza del supporto. Far scorrere la seconda pinza per siringa lungo la siringa di iniezione finché non sia premuta saldamente contro la parte inferiore del supporto per siringhe. Stringere delicatamente la pinza con l'esagonale a sfera da 0,05 pollici fornito.

Successivamente, inserire il supporto della siringa nel supporto della pipetta. Far scivolare delicatamente l'iniettore della pipetta nella siringa di iniezione e assicurarsi che la punta dello stantuffo entri direttamente nel foro della siringa. Una volta inserito completamente, avvitare il collare di bloccaggio del supporto della siringa nell'iniettore della pipetta.

Prima di caricare la soluzione del campione proteico A a C sei prime uno occhio, utilizzare il sistema di lavaggio della cella fornito con lo strumento per lavare la cella del campione con almeno 50 millilitri di buffer di corsa. Rimuovere il buffer residuo dalla cella del campione per aspirazione con una siringa di vetro da 2,5 millilitri dotata di ago lungo. Rimuovere le soluzioni dal vuoto di degasaggio utilizzando un secondo ago lungo pulito e asciutto.

Siringa da 2,5 millilitri. Aspirare con attenzione almeno 1,8 millilitri del campione proteico A a C sei primi uno occhio nella siringa. Prestare attenzione per evitare bolle d'aria.

Una volta caricata la siringa con il campione proteico, inserire l'ago nella cella del campione e toccare delicatamente il fondo della cella. Sollevare l'ago di circa un millimetro e iniettare delicatamente il campione nella cella fino a quando il liquido in eccesso diventa visibile sopra la parte superiore della cella del campione. Per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate, sollevare l'ago di circa un centimetro assicurandosi che la soluzione rimanga nel trabocco ed estrarre e reiniettare rapidamente circa 0,25 millilitri della soluzione.

Ora far scivolare delicatamente l'ago verso l'alto lungo il lato del trabocco. Nel pozzetto del campione, l'ago incontrerà un gradino. Aspirare tutto il liquido al di sopra di questo gradino, poiché esso indica l'altezza desiderata per la soluzione di corsa.

Per caricare la siringa di iniezione, collegare la siringa di gonfiaggio in plastica al porto di riempimento e abbassare la punta dello stantuffo fino all'estremità superiore del porto di riempimento. Posizionare ora il tubo di riempimento della pipetta contenente la soluzione del legante DGA sul fondo del supporto per pipette. Verificare che la punta della siringa non tocchi il fondo del tubo di riempimento ed aspirare lentamente la soluzione nella siringa fino a quando una piccola quantità entra nel tubo della siringa di caricamento.

Successivamente, chiudere il portello di riempimento abbassando la punta dello stantuffo. Questa operazione viene eseguita cliccando sul pulsante di chiusura del portello di riempimento. Quindi rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero essersi intrappolate durante il caricamento.

Svuota e ricarica facendo clic sul pulsante di svuotamento e ricarica. Ripeti lo svuotamento e la ricarica per un totale di tre volte. Al termine del processo di svuotamento e ricarica, rimuovi il tubo di riempimento dal supporto della pipetta e pulisci delicatamente la punta della siringa con carta da laboratorio.

Ora abbassare la siringa dell'assemblaggio della pipetta nel campione. È necessario procedere con cautela e lentamente, poiché l'ago può piegarsi facilmente. Assicurarsi che la siringa sia completamente inserita premendo verso il basso sulla base del collare di bloccaggio.

Dopo aver fissato la siringa, impostare la temperatura di esercizio desiderata e selezionare una potenza di riferimento leggermente superiore al massimo flusso di calore previsto per l'iniezione. In questo esempio, vengono utilizzate rispettivamente 20 gradi Celsius e 20 microcalorie al secondo come temperatura di esercizio e potenza di riferimento. Quindi programmare i volumi di iniezione e i ritardi desiderati.

Qui vengono utilizzate 28 iniezioni, di cui la prima con un volume di due microlitri e un ritardo di 62 secondi, e le iniezioni successive con un volume di 10 microlitri e ritardi di 332 secondi. L'esperimento qui descritto fornisce le basi per generare un insieme di dati a una singola concentrazione, necessario per ottenere le curve aggiuntive. Ripetere questo processo con concentrazioni decrescenti di macromolecola e ligando.

Assicurarsi che tutti i campioni di macromolecole e ligandi provengano dalla stessa soluzione madre per minimizzare gli errori nelle concentrazioni. Qui viene mostrato il tracciato grezzo di calorimetria di titolazione isoterma ottenuto dalla titolazione di ligando acetil coenzima A 3,86 millimolare in 192 micromolare della micromolecola. A A C sei primi uno.

I valori integrati degli occhi sono stati utilizzati per determinare i parametri di legame mediante un adattamento sequenziale a due siti. Questo grafico rappresenta le isoterme generate dalla calorimetria isotermica di titolazione (ITC) con diverse concentrazioni di ACE Coenzima A e AAC C sei Prime One Eye. I dati sperimentali, rappresentati da cerchi vuoti, sono stati adattati sia a un modello indipendente a due insiemi di siti, sia a un modello sequenziale a due siti.

Si osserva un accordo migliore con il modello sequenziale a due siti. Le concentrazioni proteiche utilizzate sono definite nel testo accompagnatorio. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale essere molto precisi nella diluizione, poiché le variazioni di concentrazione possono avere un impatto drastico sui risultati.