Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

L'obiettivo generale di questa procedura è dedurre il tropismo virale in un paziente infettato da HIV mediante il sequenziamento della regione V3 del gene dell'involucro virale, iniziando con l'estrazione dell'RNA dell'HIV dal plasma sanguigno del paziente. Successivamente, amplificare la regione V3 della GP120 dell'HIV mediante PCR nested con trascrizione inversa. Quindi, identificare la presenza del prodotto mediante elettroforesi su gel, seguita da sequenziamento basato su popolazione dei prodotti V3 amplificati.

Infine, analizzare le sequenze utilizzando un software di chiamata delle basi e dedurre l'uso del co-recettore mediante l'algoritmo da genoma a fenotipo. In definitiva, questi risultati possono indicare se la popolazione virale di un paziente è R5 o non R5 attraverso il sequenziamento basato su popolazione del loop V3 dell'HIV. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai test su popolazione rispetto alle metodiche esistenti, come i saggi fenotipici basati su cellule, consiste nella possibilità di eseguirlo in qualsiasi laboratorio dotato di apparecchiatura per il sequenziamento, a costi ridotti, in minor tempo e con minor quantitativo di materiale iniziale.

Questa tecnica è rilevante per il trattamento con terapia antiretrovirale perché può identificare se la popolazione virale di un paziente è probabile che risponda a un antagonista del CCR5. Da 500 microlitri di plasma, utilizzare un estrattore automatico Easy Mag per estrarre l'RNA del virus dell'immunodeficienza umana (H-I-V-R-N-A). Successivamente, spostarsi in una stanza PCR priva di contaminazioni per allestire la RT-PCR, al fine di garantire un campionamento adeguato della popolazione virale.

Prevedere di eseguire ogni reazione di trascrizione inversa in triplice replicato in questa reazione in un unico passaggio. Utilizzare l'RNA virale per sintetizzare il cDNA, amplificando specificamente la regione HIVV tre con SQV tre F1 e CO 6 0 2 prime repair. In base ai componenti per reazione.

Preparare una soluzione madre in quantità sufficiente per il numero di campioni da amplificare, utilizzando una pipetta ripetitrice. Aggiungere 36 microlitri di mix campione in ciascun pozzetto della piastra PCR. Passare ora a una pipetta multicanale per trasferire microlitri di estratto del campione di RNA in ciascuno dei pozzetti designati. Prestare attenzione a cambiare i puntali dopo ogni aggiunta.

Una volta completato il trasferimento, coprire le pozzette con tappi a striscia per PCR. Quindi posizionare la piastra PCR in un termociclatore programmato per una PCR in un unico passaggio della regione HIVV tre. Per la PCR nested, utilizzare la riparazione dei primer SQV tre F due e CD quattro R.

Calcolare la quantità di reagente necessaria per il numero di campioni da amplificare in una stanza pulita per PCR. Preparare la miscela per PCR nested, quindi utilizzare una pipetta ripetitrice per aliquotare 19 microlitri per pozzetto in una piastra PCR pulita. Al termine della R-T-P-C-R, spostarsi in una stanza post-amplificazione.

Utilizzare una pipetta multicanale a otto canali per trasferire un microlitro del template di R-T-P-C-R nella miscela di PCR nested. Cambiare le punte dopo ogni aggiunta. Coprire le pozzette con tappi a striscia per PCR e trasferire la piastra in un termociclatore per l'amplificazione.

Rimuovere la piastra dal termociclatore dopo che la temperatura è tornata a 25 gradi Celsius. Per verificare che la regione V tre sia stata amplificata con successo, analizzare prima i prodotti mediante elettroforesi su gel. Preparare un gel di AROS al 1,6% con colorante per gel cyber safe.

Utilizzando una pipetta multicanale da 10 microlitri, trasferire otto microlitri di campioni PCR nelle rispettive pozzette. Caricare inoltre un DNA ladder in almeno una pozzetta per ogni riga.

Eseguire l'elettroforesi a circa 100 volt per 10 minuti. Visualizzare le bande mediante fluorescenza ultravioletta e documentare l'immagine con una fotografia. Registrare i campioni in cui tutte le amplificazioni triplicate sono state eseguite con successo.

Se necessario, ripetere la R-T-P-C-R per quei campioni con meno di tre amplificazioni del prodotto. I campioni di cDNA virale amplificati vengono ulteriormente verificati mediante reazioni di sequenziamento del DNA che saranno eseguite utilizzando i primer V 3 0 2 F e S QV tre R uno. Rimuovere il reagente big di dal congelatore e farlo scongelare a temperatura ambiente.

Calcolare e preparare i reagenti necessari per il numero di campioni da analizzare. Aliquotare cinque microlitri di mix di reazione per il sequenziamento nei pozzetti appropriati della piastra utilizzando una pipetta multicanale. Coprire la piastra con un fazzoletto di carta Kim e metterla da parte.

Nel frattempo, preparare una diluizione 1:15 del prodotto PCR amplificato aggiungendo 180 microlitri di acqua sterile al prodotto PCR rimanente. Pipettare un microlitro del campione diluito sul fondo della piastra appropriata. Cambiare sempre la punta tra un campione e l'altro al termine del trasferimento del campione.

Sigillare la piastra con tappi a striscia e vortexare per un secondo. Per centrifugare la piastra, impostare la velocità a 140 5G. Quando la velocità di rotazione raggiunge 140 5G, arrestare la centrifugazione.

Posizionare la piastra in un termociclatore per far avvenire la reazione. In ogni pozzetto precipitare il DNA con quattro microlitri di acetato di sodio 3 M e 40 microlitri di etanolo al 95% freddo, quindi richiudere i tappi. Vortexare la piastra per 10 secondi e battere leggermente la piastra per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Collocare le piastre a meno 20 gradi Celsius per un periodo compreso tra 30 minuti e due ore. Recuperare il DNA mediante centrifugazione a 2000 ×g per 20 minuti. Rimuovere e scartare i tappi a striscia.

Rovesciare la piastra sopra il contenitore dei rifiuti e decantare il soprannatante. Rimuovere eventuali residui di soprannatante tamponando le piastre capovolte su un tovagliolo di carta.

Piegare due fogli di carta assorbente per inserire la piastra al loro interno. Posizionare la piastra capovolta nella centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 140 5G, fermando la centrifuga quando raggiunge 140 5G.

Quindi lavare con 155 microlitri di etanolo al 95% e decantare. Ripetere quindi la centrifugazione. Lasciare riposare la piastra per due-cinque minuti per consentire l'evaporazione di eventuali residui di etanolo.

Per denaturare i campioni di DNA, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 10 microlitri di colorante ad alta densità in tutti i pozzetti della piastra, inclusi quelli vuoti. Sigillare la piastra con un settimo e posizionarla in un termociclatore a 90 gradi Celsius per due minuti. Infine, inserire la piastra dei campioni in una piastra per sequenziamento e quindi nel sequenziatore.

Un percorso accettabile per l'analisi dei dati consiste nell'utilizzare il software recall per eseguire la chiamata automatica delle basi senza alcun intervento umano. Recall è un software gratuito basato su impostazioni personalizzate: effettuare l'accesso e selezionare i file campione da caricare tramite l'opzione di navigazione. Individuare il file dei dati di sequenziamento grezzi e caricare fino a 20 megabyte.

Successivamente, impostare la sequenza di riferimento su V tre. Fare clic su elabora dati. Selezionare la cartella risultante sul lato destro della pagina per visualizzare l'elenco dei campioni.

Quelli rossi hanno fallito. Quelli verdi hanno superato il test. Cliccando su un campione specifico e sul pulsante "Visualizza", è possibile esaminare la sequenza, seguire le istruzioni riportate sul lato destro della pagina per navigare all'interno della sequenza e scaricare i file in una cartella compressa zip.

Il tropismo virale può essere dedotto dalle sequenze generate mediante sequenziamento basato su popolazione, utilizzando l'algoritmo genotipo-fenotipo per il co-recettore. Dal menu a discesa dell'impostazione significativa, selezionare l'opzione ottimizzata in base all'analisi dei dati clinici provenienti da motivate al 2% e 5,75% FPR. Scegliere ora di caricare o incollare una sequenza per l'analisi.

Sono accettabili file FASTA. Non aggiungere altri passaggi per ottenere un predittore genotipico FPRA della risposta agli antagonisti del CCR5. Il rapporto G2P generato fornisce la sequenza del loop V3 in amminoacidi e indica le posizioni rilevanti delle mutazioni associate a virus non R5.

In fondo al rapporto, viene indicato il tasso di falsi positivi e interpretato in termini di risposta a un antagonista del CCR5. Questo rapporto può essere scaricato come file PDF. Se una qualsiasi delle tre sequenze di un campione viene classificata come non R5, è improbabile che il paziente risponda a un antagonista del CCR5, come previsto. L'elettroforesi su gel degli amplificati RTP CR del loop V3 dell'HIV-1 indica che non tutti i campioni clinici producono un prodotto.

Le sequenze generate dai campioni amplificati possono essere visualizzate in un cromatogramma letto mediante richiamo. Ci si aspetta una sequenza pulita con poche sovrapposizioni. Occasionalmente, le sequenze possono risultare confuse e non adatte a un'assegnazione accurata delle basi.

Alcuni pazienti possono essere identificati come portatori di virus che non utilizzano CCR5, come mostrato qui. Questi pazienti probabilmente non risponderanno al trattamento con un antagonista di CCR5. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti presenta una popolazione virale composta da virus che utilizzano CCR5, come indicato da un riquadro verde nella parte inferiore del rapporto di analisi G2P.

Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro giorni, dall'inizio alla fine, ovvero dall'estrazione all'analisi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come prevedere il tropismo virale utilizzando metodi di sequenziamento basati sulle popolazioni in combinazione con l'algoritmo bioinformatico genome pheno.

Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.