Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare cellule e microsfere all'interno di dispositivi microfluidici utilizzando l'elettroforesi dielettrica, o DEP, mediante schede a circuito stampato (PCB). Questo risultato si ottiene innanzitutto progettando e preparando gli elettrodi in PCB e i canali microfluidici. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare l'assemblaggio microfluidico su PCB e le soluzioni di microsfere e cellule.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel riempire i canali con un mezzo a bassa conducibilità, quindi caricare le perle e le cellule. L'ultimo passaggio della procedura è collegare l'assemblaggio PCB all'amplificatore di potenza e al generatore di funzioni, quindi avviare la DEP. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la separazione e la manipolazione di cellule e perle in dispositivi microfluidici mediante l'utilizzo della DEP.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché è necessario che l'utente comprenda i principi della DEP al fine di sviluppare un elettrodo efficace, da utilizzare con un dispositivo microfluidico, per la manipolazione di cellule o microsfere. D'altro canto, l'uso di circuiti stampati (PCB) come elettrodi rende la manipolazione di cellule e microsfere nei dispositivi microfluidici accessibile a diverse discipline scientifiche. Il primo passo di questa procedura consiste nel progettare gli elettrodi del circuito stampato (PCB) con la geometria desiderata per generare un campo elettrico non uniforme.

Una volta completata la progettazione, ordinare le schede elettrodi PCB personalizzate presso un'azienda commerciale di produzione. Dopo aver ricevuto il PCB personalizzato, aprirlo e ispezionarlo per questa dimostrazione. Il PCB è lungo 8,4 centimetri e largo 2,1 centimetri.

Gli elettrodi metallici hanno una larghezza di cinque millimetri. In questo esempio, gli elettrodi presentano due strisce metalliche lunghe e due regioni trasversali lunghe 4,5 millimetri in cui gli elettrodi sono intrecciati. Queste regioni intrecciate generano un campo elettrico non uniforme intenso, necessario per creare una connessione tra lo stimolatore e l'elettrodo del circuito stampato (PCB).

Posizionare un filo da 16 gauge all'estremità dell'elettrodo. Utilizzare un saldatore caldo per tenere il filo in posizione sull'area metallica della PCB. Questo riscalda il filo.

Tenere il saldante sul filo riscaldato e permettere a una piccola quantità di saldante di fluire all'interno del filo. Una volta che il filo è riempito di saldante, rimuovere la saldatura tenendo il filo in posizione mentre il saldante si raffredda. Ripetere il processo di saldatura per l'altra connessione elettrica sulla PCB.

Il passo successivo consiste nel preparare canali microfluidici con il modello di ramificazione desiderato. Utilizzando tecniche standard di microfabbricazione, creare un modello maestro per definire i canali, impiegando una piastrina di silicio e il photoresist SU eight. Questo modello maestro presenta un canale di ingresso e tre canali target.

La larghezza dei canali è di 100 micrometri e l'altezza dei canali è di 27 micrometri. Una volta creato il modello master, mescolare il polimetil LAANE o l'elastomero PDMS con un agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1 per cinque minuti. Versare il PDMS liquido sul modello master SU eight prefabbricato ed eliminare le bolle d'aria esponendo il PDMS liquido al vuoto per tre minuti.

Ripetere il processo a vuoto se necessario per rimuovere completamente tutte le bolle. Un flusso di gas azoto può essere utilizzato per rimuovere eventuali bolle residue, se necessario. Polimerizzare il PDMS in un forno a 70 gradi Celsius per due ore.

Utilizzare una lametta per rimuovere dal wafer il labirinto P-D-M-S-S con i canali microfluidici, facendo attenzione a non rompere il wafer con lo spazio del canale rivolto verso l'alto. Usare una perforatrice per biopsie per praticare fori attraverso cui introdurre fluidi e cellule nel dispositivo microfluidico. Tagliare.

Qualsiasi eccesso di PDMS. Ispezionare il dispositivo microfluidico per assicurarsi che sia privo di polvere e detriti. Utilizzare nastro adesivo 3M Scotch Magic per pulire il PDMS.

Esponi i canali in PDMS e un'ampolla di vetro numero zero pulita con uno spessore compreso tra 80 e 130 micrometri al gas al plasma per 1,5 minuti. Rimuovi il laboratorio in PDMS e l'ampolla di vetro dal pulitore al plasma in una piastra di Petri; effettua il legame al plasma posizionando i canali microfluidici in PDMS con la parte inferiore rivolta verso il basso sull'ampolla di vetro. Riscalda l'insieme microfluidico composto da ampolla di vetro e PDMS su una piastra riscaldata impostata a 100 gradi Celsius per almeno 15 minuti. L'ultimo passaggio nella preparazione del dispositivo microfluidico consiste nel posizionare i canali in PDMS e l'ampolla di vetro sopra gli elettrodi della PCB.

Iniziare posizionando circa 10 microlitri di olio minerale sulla PCB. Per garantire un contatto stretto tra la PCB e il vetrino, posizionare l'assiemblea del canale microfluidico con il vetrino sulla PCB oliata con il vetrino. A contatto con l'olio, premere delicatamente l'assiemblea microfluidica con il vetrino verso il basso per assicurare un buon contatto e ridurre al minimo le bolle d'aria che potrebbero compromettere la visualizzazione delle cellule e delle microsfere.

Un altro passaggio importante è preparare la miscela di mezzo a bassa conducibilità, costituita da saccarosio all'8,5% e glucosio allo 0,3% (peso su volume) in acqua deionizzata. Il dispositivo microfluidico è ora pronto per l'uso: utilizzando una pipetta, riempire ogni canale microfluidico con da 15 a 20 microlitri del mezzo a bassa conducibilità, se necessario. Utilizzare l'aspirazione sotto vuoto per rimuovere eventuali bolle d'aria nei canali.

Il passo successivo consiste nell'introdurre le particelle di prova nel dispositivo microfluidico. Questa dimostrazione utilizza una sospensione di 550 perle di polistirene per microlitro di mezzo a bassa conducibilità; poiché le perle possono sedimentare nel tempo, ri-sospendere le perle agitando. Successivamente, utilizzando una pipetta, introdurre 200 microlitri della sospensione di perle di polistirene nel canale.

Il passo successivo consiste nel preparare gli elettrodi, collegando l'uscita di un generatore di funzioni all'ingresso di un amplificatore di potenza in corrente alternata. Successivamente, collegare l'uscita dell'amplificatore ai cavi degli elettrodi. Coprire tutti i cavi elettrici e le superfici elettriche dell'apparato con del nastro isolante per proteggere l'utente da possibili contatti con scosse elettriche.

Impostare il generatore di funzioni per produrre un'onda sinusoidale in uscita da uno a 1,5 megahertz. Avviare la DEP per iniziare la separazione di cellule e microsfere in questa configurazione. Il canale di ingresso è a destra e i tre canali bersaglio si separano al giunto triforcuto.

Gli elettrodi PCB corrispondono alle strisce nere senza flusso laminare e senza DEP. I microsferini sono essenzialmente stazionari all'avvio della DEP, ma in assenza di flusso. I microsferini migrano verso gli elettrodi PCB e lontano dallo spazio tra gli elettrodi quando il flusso laminare è attivo.

Tuttavia, in assenza di DEP, le microsfere che scorrono attraverso i canali di ingresso vengono suddivise tra i tre canali target. Quando viene attivato il DEP e il flusso laminare è presente, le microsfere vengono indirizzate a fluire esclusivamente nel canale centrale. Nei prossimi video, il dispositivo microfluidico viene ruotato sopra gli elettrodi PCB, provocando un cambiamento nell'orientamento dei canali.

Rispetto agli elettrodi del PCB, il canale di ingresso, che precedentemente era perpendicolare agli elettrodi del PCB, è ora quasi parallelo agli elettrodi con il flusso laminare attivo. Tuttavia, con la forza dielettroforetica disattivata (DEP off), le microsfere entrano in modo uguale in tutti e tre i canali bersaglio.

Quando viene attivata la DEP, le perline si avvicinano al punto di triforcazione e la forza dielettroforetica spinge le perline nel canale laterale sopra l'elettrodo. Questo successivo insieme di figure nel video mostra una miscela di cellule di adenocarcinoma del colon umano o cellule HT 29 e perline fluorescenti all'interno del dispositivo microfluidico. In questa immagine DIC, la freccia aperta indica la direzione del flusso laminare, e i canali sono delineati con linee tratteggiate.

Gli elettrodi metallici riflettenti possono essere visti come la striscia chiara sullo sfondo; la microscopia DIC viene utilizzata per acquisire immagini delle perline durante il fenomeno di luminescenza. Intensità della scala. Le immagini vengono utilizzate per rendere le cellule più visibili.

Questa figura è la stessa immagine dell'altra figura, ma mostrata come un'immagine di intensità su scala cromatica, utile per visualizzare sia le cellule che le perle. Le elettrodi metallici riflettenti appaiono come strisce gialle e verdi in questa figura. Con la DEP, le perle escono dal canale destro come mostrato nell'immagine DIC, mentre le cellule HT 29 escono dai canali centrale e sinistro, come mostrato nell'immagine su scala cromatica prima dell'avvio della DEP. Una soluzione mista di cellule e perle fluisce da un canale di ingresso verso i tre canali target separati.

Dopo aver indotto la DEP, le microsfere e le cellule vengono attivate selettivamente in canali separati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniziare a implementare l'elettroforesi a disco per la manipolazione di cellule e microsfere all'interno di dispositivi microfluidici.