Murino pancreatica isolamento Islet

Ciao, sono Greg Zott. Lavoro presso il Centro per il Diabete dell'UCSF, nel laboratorio di Bluestone, e oggi vi mostrerò il procedimento per isolare le isole pancreatiche di topo. Il protocollo prevede l'iniezione di una soluzione di collaghenasi nel pancreas di un topo donatore C3H, quindi l'asportazione del pancreas, la sua digestione, la purificazione delle isole su un gradiente di Ficoll, e infine la selezione manuale delle isole per il trapianto finale nella capsula renale di un topo NOD diabetico, che fungerà da ricevente.

Prima di iniziare questa procedura, abbiamo diluito la nostra soluzione ATE in un buffer di Hanks modificato e abbiamo aggiustato la concentrazione specifica per la linea di topo che stiamo utilizzando, la C3 H. Abbiamo riscontrato un migliore digestione con una soluzione di collaghenasi a 0,8 mg per ml, e utilizzeremo questa per iniettare nel dotto biliare comune al fine di distendere il pancreas. La procedura di oggi sarà eseguita da Pavo Codre del centro per il diabete. Egli effettuerà l'iniezione, aprirà il topo, esporrà l'intestino e quindi inietterà nel dotto biliare comune.

Tratteremo il topo con etanolo per appiattirne il pelo, quindi verificheremo anche che il topo sia stato sacrificato correttamente mediante una compressione del dito del piede. Pavo ora aprirà il topo ed esporrà l'intestino e il pancreas mediante un'incisione mediana. Il diaframma verrà inoltre reciso per confermare che il topo sia stato sacrificato.

Prima di iniziare, vorrei evidenziare alcune delle strutture importanti. Lo stomaco si trova proprio qui, con il pancreas attaccato al di sotto e al di sopra del duodeno. Questo è il fegato, dove troveremo la cistifellea e il dotto biliare comune, che potete vedere proprio qui.

Quello che Pavo farà successivamente è isolare l'intestino tenue e individuare il punto in cui il dotto biliare comune entra nell'intestino tenue. Una volta esposto l'intestino, applichiamo clampi a forbice da entrambi i lati del dotto biliare comune. Abbiamo riscontrato che questo metodo permette a un maggior numero di collagenasi di entrare nel pancreas, mentre altri gruppi cercano di posizionare il clamp direttamente sul dotto biliare comune.

Abbiamo constatato che questa è una tecnica migliore per consentire all'enzima di entrare nel pancreas. Si tratta di una procedura delicata. Non si deve lacerare l'intestino.

Si desidera posizionare delicatamente le pinze su entrambi i lati del dotto biliare comune. Ora individueremo la cistifellea e, una volta esposta, la utilizzeremo come guida per iniettare la collagenasi nel dotto biliare comune. Powell utilizza un ago da 30 gauge con una siringa da cinque cc contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi.

Mentre entra nel dotto biliare comune, dilata tale dotto con soluzione di collaghenasi, quindi procede lungo il dotto biliare comune finché non raggiunge la zona vicina all'intestino. E mentre procede in basso, la soluzione enzimatica viene pompata e iniettata nel pancreas. Ora che il pancreas è gonfio con la soluzione di collaghenasi, Powell rimuoverà i forceps emostatici e quindi asporterà il pancreas dal topo, staccandolo con cura dall'intestino.

Lo rimuove dallo stomaco. Ok, quindi utilizzando la milza come maniglia, solleva il pancreas e poi lo stacca lentamente dal dotto biliare comune, e questo è tutto. Il pancreas viene disteso, quindi la milza viene rimossa; ora sta eliminando il tessuto mesenterico, dopodiché il pancreas viene posto in una soluzione di collagenasi 2 mill e in un vial di vetro sterilizzato, e infine rimesso sul ghiaccio.

Il pancreas isolato che abbiamo inserito nei vial di vetro verrà ora posto in un bagno d'acqua a 37 gradi per circa 17 minuti. Li abbiamo posizionati su un supporto conico da 50 ml in modo che non galleggino. Non appena inizia il bagno, si attiva il timer e inizia la digestione.

Una volta terminato il tempo di digestione, i vialli vengono rimossi, quindi agitati e sottoposti a una leggera disgregazione. E una volta che il tessuto inizia a disfarsi, il viallo viene quindi posto sul ghiaccio. Viene posizionata una rete sterile sopra un becher da 400 mil che contiene il buffer di lavaggio.

Il digestato del pancreas viene quindi versato con attenzione sul setaccio nel buffer di lavaggio. A scopo dimostrativo, la cappa è stata spenta e il vetro della cappa è stato alzato in modo da poter vedere ciò che stiamo facendo. Una volta versato il digestato del pancreas nel becher, le provette vengono risciacquate con lo stesso buffer di lavaggio e il buffer di lavaggio viene posto sul setaccio.

Abbiamo una siringa riempita con tampone di lavaggio. Useremo questa per lavare energeticamente il tessuto attraverso il setaccio. L'idea è quella di rilasciare eventuali anelli liberi non attaccati alla matrice, lasciando invece sul setaccio le membrane e il tessuto non digerito.

E quando hai terminato di lavare un tessuto, questo è ciò che di solito si osserva alla fine della procedura. Il tessuto pancreatico presente sul fondo del tubo verrà ora trasferito in due conici da 50 ml, il tessuto verrà lavato, mescolato uniformemente e quindi distribuito in modo omogeneo in modo da ottenere un volume di pellet uguale in ciascun tubo. Il becher viene ora risciacquato con ulteriore tampone di lavaggio.

I lati vengono risciacquati in modo da recuperare tutto il tessuto finito nuovamente nel becher. Successivamente, il campione viene distribuito equamente tra due provette, entrambe da 50 ml. Le provette vengono quindi portate a volume con buffer di lavaggio.

Il tessuto viene capovolto più volte e quindi inserito in una centrifuga. Si tratta di una breve centrifugazione. Si permette alla centrifuga di raggiungere mille giri al minuto, dopodiché viene spenta.

In questo momento il tessuto è molto sensibile e gli occhielli sono molto delicati, quindi è importante non compattarli eccessivamente. I tubi vengono rimossi e si ripete questo passaggio di lavaggio altre tre volte. Questo è il termine del terzo lavaggio.

I componenti del tubo conico da 50 ml vengono trasferiti nel tubo conico da 15 ml e centrifugati a mille giri al minuto, quindi fermati. Il soprannatante verrà rimosso e si inizierà la prima parte della FI Call. Siamo arrivati al passaggio in cui abbiamo il pellet del digestato di pancreas.

Risospenderemo il tessuto in modo che risulti ben sciolto rispetto ai pellet. Aggiungeremo il primo gradiente di densità, ovvero 1 1 0 8. Aggiungeremo cinque mil a ogni provetta.

Il pellet viene quindi mescolato accuratamente in ciascuno dei gradienti. È importante ottenere una buona distribuzione del tessuto nel gradiente più denso. Ora stratificheremo due millilitri di densità 1 0 9 6.

Successivamente, aggiungeremo uno strato di due mils di densità 1 0 6 9, e sopra a questo uno strato di densità 1 0 3 7. È importante che, durante l'aggiunta delle densità, non si verifichi mescolamento. A questo punto, tutti gli strati sono stati aggiunti al tubo.

E si può notare che questa è la parte superiore di 1 1 0 8, la parte superiore di 9 1 0 9 6, la parte superiore di 1 0 6 9 e la parte superiore di 1 0 3 7. Si può osservare che il tessuto ha già iniziato a migrare verso la propria densità corretta, anche senza la centrifugazione. I gradienti in fiala vengono portati a regime a 1800 giri/min per 15 minuti e ricordare di mantenere il freno disattivato dopo aver rimosso le provette dalla centrifuga.

Si può osservare tra il livello 0 0 9 6 e il livello 0 0 7 una bella banda di tessuto degli isolotti di Pablo. Ora viene rimosso il livello 0 3 7 per eliminare eventuali detriti tessutali e DNA che potrebbero essere stati rilasciati durante l'elaborazione. Utilizzando una pipetta Pasteur in plastica sterile, provvederà ora a rimuovere il livello degli isolotti e a trasferirlo in un tubo conico da 50 ml contenente 25 ml di tampone di lavaggio.

È necessario eseguire questo passaggio rapidamente perché il fol è tossico per gli occhielli. In realtà abbiamo rimosso l'intero strato 0 6 9 e 0 9 6. Pavo taglia la parte superiore della pipetta in plastica per pascolo e la risciacqua con il buffer di lavaggio.

I capillari vengono quindi centrifugati come abbiamo fatto in precedenza. La centrifuga viene portata a mille giri al minuto, poi viene fermata ed eseguiamo l'aspirazione. I capillari del soprannatante verranno lavati tre volte con il mezzo di lavaggio.

Abbiamo appena completato il processo di isolamento delle palpebre: siamo passati dalla digestione al gradiente di fol al campione purificato di occhielli, dopo il terzo lavaggio con tampone di lavaggio. Abbiamo quindi risospeso gli occhielli nel nostro mezzo RPMI e li abbiamo trasferiti in una piastra per colture cellulari. Questi occhielli sono ora pronti per saggi in vitro o preparazioni in vivo, come il trapianto di occhielli.