Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere la struttura tridimensionale del complesso dell'esosoma utilizzando il metodo dell'inclinazione conica casuale. Questo risultato si ottiene innanzitutto depositando uno strato sottile di film di carbonio sulla griglia di carbonio forata per creare il substrato di supporto per il complesso proteico e, in un secondo passaggio, per il colorante. Il campione e il colorante vengono applicati sulla griglia, il che provoca l'inclusione del campione in sali di metalli pesanti.

Successivamente si esegue la microscopia elettronica per ottenere coppie di micrografie inclinate del campione. Infine, si ottengono risultati che mostrano la struttura tridimensionale del complesso dell'esosoma basata sull'analisi delle immagini mediante il metodo dell'inclinazione conica casuale. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché a volte la preparazione adeguata del campione per il metodo dell'inclinazione conica casuale è complessa, così come la procedura di elaborazione delle immagini che segue View.

La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di valutazione del grado e di preparazione del campione sono difficili da apprendere senza un'illustrazione della valutazione del campione. Il principio del metodo dell'inclinazione conica casuale richiede di acquisire una coppia di microfotografie della stessa regione di un campione all'interno del microscopio elettronico. Un'immagine viene catturata con il campione in posizione non inclinata, e l'altra immagine viene catturata con il campione inclinato di un angolo compreso tra 50 e 70 gradi. Mediante l'uso del computer, la coppia di microfotografie digitalizzate viene posizionata affiancata e vengono selezionate le immagini degli stessi particelle in questa illustrazione.

Queste immagini sono contrassegnate da numeri in coordinate tridimensionali. Le immagini delle particelle non inclinate e quelle delle loro controparti inclinate sono correlate tra loro in base alla direzione dell'asse di inclinazione e all'angolo di inclinazione. L'allineamento delle immagini delle particelle non inclinate porta le immagini delle particelle inclinate nelle rispettive posizioni corrispondenti; utilizzando più immagini di particelle inclinate che riempiono lo spazio azimutale, la struttura tridimensionale della molecola può essere ricostruita mediante un algoritmo di retroproiezione. Per fabbricare le griglie, preparare innanzitutto una soluzione di form VAR allo 0,5% aggiungendo 0,45 grammi di resina di polivinilformale e 90 millilitri di cloroformio a un becher di vetro da 100 millilitri.

In una cappa, coprire il becher con della pellicola di alluminio e sciogliere la resina form-var. Con l'aiuto di una piccola barretta di agitazione e di un agitatore magnetico, la resina impiega circa 15 minuti a sciogliersi. Nel frattempo, pulire le lamelle di vetro per microscopia già pre-pulite con metanolo e con salviette Kim.

Dopo che la resina in forma di var è completamente disciolta nel cloroformio, aggiungere un millilitro di glicerolo al 50% sulla superficie della soluzione. La modulazione del volume di glicerolo aggiunto influenza la densità dei fori nel carbonio forato.

Inclinare la punta di un ultrasonico nella soluzione. A una profondità di circa 2,5 cm, utilizzare la potenza massima per sottoporre a sonicazione per un minuto, creando così un'emulsione di goccioline di glicerolo nella forma della nostra soluzione. Una sonicazione più lunga provocherà una riduzione delle dimensioni dei fori nel carbonio forato.

La soluzione diventa torbida dopo questo passaggio. Immediatamente dopo l'immersione in sonica, immergere verticalmente le vetrini puliti nell'emulsione. Estrarli per un secondo e asciugare la parte inferiore dei vetrini utilizzando carta filtrante per formare un sottile film di plastica sulla superficie dei vetrini.

Dopo l'evaporazione del cloroformio, verificare la densità e le dimensioni dei fori nel film al microscopio ottico. La condizione di preparazione qui descritta dovrebbe produrre da 10 a 20 fori in ciascun quadrato di una griglia da 400 maglie, con diametri compresi tra tre e quattro micrometri. Una volta che i vetrini sono asciutti, tagliare il bordo del film di plastica sulla superficie del vetrino.

Fare galleggiare il film sulla superficie dell'acqua distillata immergendo verticalmente il vetrino nell'acqua. Il film sottile sulla superficie dell'acqua può essere osservato con un angolo radente rispetto al riflesso della luce. Posizionare le griglie di rame da 400 mesh sul film, una alla volta, con la superficie liscia della griglia rivolta verso il basso.

Prendere il film di plastica con la griglia utilizzando un pezzo di carta. Capovolgere la carta e lasciarla asciugare. In una piastra di Petri, immergere la carta nel metanolo per rimuovere la glicerolo residuo dai fori e lasciare asciugare all'aria.

Utilizzare un evaporatore al carbonio per ricoprire le griglie con uno strato di carbonio di uno spessore di circa 20 nanometri. Utilizzare il tempo di evaporazione per controllare lo spessore desiderato. Lo spessore può essere determinato confrontando il colore grigio del carbonio con quello di uno strato di carbonio di spessore noto.

Inzuppare le griglie con strato di carbonio in cloroformio in una capsula di Petri di vetro per mezz'ora per rimuovere la colla, seguito dall'essiccazione delle griglie, ottenendo così griglie di carbonio forate fatte in casa. Successivamente, evaporare un sottile strato di carbonio di circa cinque nanometri di spessore su una superficie fresca di mica. Quindi posizionare con cura le griglie di carbonio forate su un pezzo di carta da filtro sotto acqua distillata.

In un apparato casalingo, far galleggiare il sottile strato di carbonio dalla superficie della mica sulla superficie dell'acqua e depositarlo lentamente su griglie di carbonio forate. Prelevare la carta da filtro con le griglie e lasciarla asciugare. In una cappa chimica, iniziare la colorazione negativa del complesso di esosomi preparando una soluzione fresca di formiato di uranile al 2%.

Come descritto nella procedura scritta, coprire il tubo della soluzione con un pezzo di alluminio per evitare l'esposizione alla luce; la soluzione deve essere utilizzata lo stesso giorno. Eseguire una scarica al plasma su una griglia di carbonio sottile interamente coperta di carbonio mediante un apparecchio per scarica al plasma. Successivamente, posizionare un pezzo di parafilm pulito sul banco e pipettare tre gocce da 50 microlitri di soluzione di colorante di formiato di uranile sulla superficie del parafilm, diluire il complesso di esosomi a una concentrazione di circa 50 nanomolari utilizzando tampone di diluizione, quindi pipettare quattro microlitri della proteina diluita sulla griglia sottoposta a scarica al plasma.

Lasciare il campione sulla griglia per un minuto, quindi asciugare la soluzione residua con un pezzo di carta da filtro utilizzando pinzette. Capovolgere immediatamente la griglia sopra la prima goccia di colorante e risciacquare la griglia muovendola avanti e indietro più volte per circa 10 secondi. Ripetere questo procedimento per ciascuna delle tre gocce di colorante; dopo l'ultimo risciacquo, lasciare il colorante sulla griglia per un ulteriore minuto.

Quindi rimuovere la colorazione con un pezzo di carta filtrante. Mantenere uno strato sottile di soluzione di colorante sulla superficie della griglia e lasciare asciugare la griglia in una cappa. Posizionare la griglia del campione nel portacampione e quindi inserire il portacampione in un microscopio elettronico FEI TE nine 12.

Controllare la griglia del campione a bassa ingrandimento per individuare i quadrati meglio colorati. Un buon quadrato presenta una dozzina di fori con dimensioni di circa uno-due micrometri e aree scure colorate al loro interno. Attivare la modalità a bassa dose dell'interfaccia utente FEI e allineare la messa a fuoco di ricerca e la posizione di esposizione in modalità a bassa dose.

Impostare la ricerca in modalità frazionamento con una lunghezza della camera di 1,5 metri. Impostare il fuoco su un'ingrandimento di 150 K e impostare l'esposizione su un ingrandimento di 50 K con un tempo di esposizione misurato di un secondo. Normalmente, una caratteristica riconoscibile sulla griglia in entrambe le modalità, ricerca ed esposizione, viene utilizzata per eseguire l'allineamento.

Trova i fori con una buona colorazione in modalità ricerca e salva le posizioni. Acquisisci un'immagine CCD del quadrato. Inclina il campione di 55 gradi ed acquisisci un'altra immagine.

Confronta le due immagini e identifica i fori corrispondenti nelle due microfotografie. Riporta lo stadio a zero gradi. Utilizza il kit a bassa dose per acquisire immagini di ciascun foro identificato in modalità di ricerca ad alta ingrandimento con un defocus di circa meno 0,7 micrometri.

Dopo aver scattato le immagini di tutti i fori, inclinare la fase a 55 gradi utilizzando lo stesso ingrandimento. Acquisire microfotografie del campione inclinato con un defuoco di circa meno 1,2 micrometri. Identificare la coppia corrispondente di microfotografie inclinate in base ai modelli osservati nelle microfotografie a basso ingrandimento, utilizzando il pattern irregolare delle griglie di carbonio forate fatte in casa.

Per facilitare la correlazione, scegliere coppie di micrografie a inclinazione con particelle distribuite in modo uniforme e senza aloni attorno alle particelle. Le micrografie con evidenti aloni di colorante attorno ad esse devono essere scartate per elaborare i dati. Iniziare con la configurazione del programma nella procedura.

La procedura di elaborazione delle immagini verrà dimostrata utilizzando il programma 2D del pacchetto Eman. Per cambiare il formato delle immagini, utilizzare il pacchetto iMagic five per eseguire l'allineamento 2D e il pacchetto spider. Per eseguire la ricostruzione e il perfezionamento 3D, convertire l'immagine digitale DM3 del Gatan nel formato immagine spider.

Utilizzando il comando process 2D, selezionare le coppie di particelle. Utilizzando il programma web distribuito nel pacchetto del programma spider, il programma salva automaticamente le coordinate delle particelle, delimitando tutte le particelle selezionate mediante lo script spider. Lo script salva gli stack di particelle inclinate e non inclinate.

Convertire le particelle inclinate UN nel formato IMAG cinque. Utilizzando il programma EM due EM con filtro passa-banda, filtrare e mascherare le particelle inclinate UN mediante il comando InCorp prep in IMAG cinque e centrare le particelle mascherate con il filtro passa-banda utilizzando il comando center. In IMAG cinque, allineare e classificare iterativamente le particelle in classi omogenee utilizzando uno script batch che esegue automaticamente i programmi di IMAG cinque.

Successivamente, utilizzare i nomi MSA nel comando class in IMAG five per generare la tabella di ricerca delle particelle, generando un file di grafico per i valori di traslazione e rotazione dell'allineamento di ciascuna particella mediante il comando header. In iMagic five, convertire le particelle allineate in formato spider utilizzando il programma EM two EM. Quindi, trasformare la tabella di ricerca delle classi in file documento spider.

I valori di traslazione e rotazione dell'allineamento per ogni particella vengono inoltre convertiti in un file documento spider con filtro passa-banda, maschera e centra le particelle inclinate esattamente come per le particelle non inclinate in IMAG cinque, generando un nuovo set di dati per le particelle inclinate centrate. Crea file documento angolari dai documenti di allineamento multiriferimento generati da IMAG cinque e dai file DCB prodotti dal programma web. Utilizza lo script di retroproiezione in spider per ottenere un modello iniziale per ciascuna media delle classi.

Infine, eseguire il perfezionamento della proiezione del volume iniziale utilizzando lo script spider su tutte le particelle non inclinate per ottenere il volume finale mediante RCT. Sono state ottenute circa 50 ricostruzioni dell'esosoma. I volumi sono generati da particelle inclinate corrispondenti a ciascuna particella nelle 50 classi di particelle non inclinate.

Utilizzando la retroproiezione implementata nel pacchetto spider, è stata quindi eseguita la raffinazione mediante abbinamento delle proiezioni, usando questi volumi come modelli iniziali, e il volume tridimensionale visualizzato dell'esosoma è stato generato a una risoluzione di circa 18 angstrom. A questo punto, possiamo inserire i modelli atomici delle diverse parti del complesso nella mappa tridimensionale. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come utilizzare la RCT per ottenere ricostruzioni tridimensionali, partendo dalla preparazione di una griglia campione adeguata fino all'acquisizione di micrografie in modalità peer-to-peer, e infine ottenere la ricostruzione mediante tecniche di analisi delle immagini. Oltre al protocollo qui descritto, esistono diversi metodi per ottenere le ricostruzioni finali nell'analisi delle immagini.

Il passaggio più critico per ottenere una ricostruzione affidabile e corretta è lavorare con un campione ben preparato.