Misurare Coordinamento motore in Mouse
29 maggio 2013
Protocolli sono presentati per due compiti stabiliti coordinazione motoria, il bar rotarod e orizzontali di accelerazione, anche due test sviluppati in Oxford di recente, le barre statiche e barre parallele. Questi test in grado di rilevare deficit motori potenzialmente di interesse in sé, oltre ad essere possibili variabili in prove di altre aree del comportamento.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la coordinazione motoria nei topi. Questo viene raggiunto eseguendo prima un test sul rotarod con accelerazione. Successivamente, la coordinazione motoria viene testata sulla sbarra orizzontale.
L'animale può anche essere sottoposto a test su barre statiche. Infine, può essere misurata la prestazione sui listelli paralleli. In definitiva, è possibile ottenere risultati che indicano se il topo presenta deficit nella coordinazione motoria.
Generalmente, le persone nuove rispetto a questa tecnica incontreranno difficoltà a causa della complessità nel posizionare correttamente il topo sull'apparecchiatura per tutti i test seguenti. Portare i topi nella stanza sperimentale da cinque a venti minuti prima del test per assicurarsi che siano completamente svegli. La scena del rotarod qui mostrata è stata realizzata presso l'Università di Oxford.
La barra ha un diametro di tre centimetri ed è dotata di una serie di creste parallele sulla superficie, che aiutano i topi ad afferrarla in modo più efficace. Una flangia su ciascun lato impedisce al topo di uscire dalla barra. Hanno un diametro di 30 centimetri e sono distanziate di sei centimetri.
La sbarra è fissata a 30 centimetri dalla base dell'apparecchiatura. Alla base viene posizionata una superficie imbottita morbida per ammortizzare eventuali cadute prima dell'inizio della prova. Preparare il rotarod impostando una velocità iniziale di quattro rotazioni al minuto e una velocità di accelerazione di 20 rotazioni al minuto.
Per iniziare, afferrare il topo per la coda e avvicinarlo alla sbarra con un angolo di 45 gradi rispetto all'orizzontale. Rilasciare rapidamente l'animale quando è quasi a contatto con la sbarra. In alternativa, il topo può essere abbassato su un'asticella, che verrà poi utilizzata per trasferire l'animale sulla sbarra.
Avviare l'accelerazione 10 secondi dopo aver posizionato il topo sulla sbarra e annotare la velocità alla quale il topo cade. Se il topo cade prima dei cinque secondi e ciò è probabilmente dovuto a un posizionamento errato da parte dell'operatore, il risultato non deve essere registrato e la prova deve essere ripetuta se il topo cade prima di 10 secondi. Annotare il tempo e concedere all'animale altre due prove.
Per gli animali che restano oltre i 10 secondi, registrare la velocità con cui l'animale cade. A volte il topo potrebbe interrompere la deambulazione e, di conseguenza, mostrare qualche movimento di agitazione attorno alla sbarra prima di cadere definitivamente. È utile annotare la velocità di questo evento.
La prestazione è calcolata come velocità media tra le prove. Ad esempio, un topo che cade prima di 10 secondi una volta e poi resiste fino a 12 rotazioni al minuto. La seconda volta ottiene un punteggio di quattro più 12 diviso due, pari a otto rotazioni al minuto.
La barra orizzontale misura la forza e la coordinazione degli arti inferiori, mentre una barra dal diametro di due millimetri è quella più comunemente utilizzata. Barre di diametro maggiore possono fornire punteggi di prestazione più accurati. Barre in ottone lunghe 38 centimetri sono mantenute a 49 centimetri sopra la superficie del banco da una colonna di sostegno in legno.
I barretti sono mantenuti in tensione quando vengono inseriti nelle scanalature dei supporti, che vengono leggermente avvicinati. Iniziare il test con il barretto di due millimetri. Tenere il topo per la coda e posizionarlo sul banco davanti all'apparato.
Fare scivolare rapidamente all'indietro di circa 20 centimetri per allineare velocemente il corpo perpendicolarmente alla sbarra. Sollevare l'animale permettendogli di afferrare la sbarra orizzontale al centro soltanto con le quattro zampe.
Lasciare andare la coda avviando contemporaneamente un cronometro. Se il topo non riesce ad afferrare la sbarra e si sospetta che la causa sia da attribuire al posizionamento da parte dell'operatore, non registrare la caduta e sottoporre nuovamente l'animale al test dopo una breve pausa.
Se il topo cade prima di cinque secondi, e ciò non è chiaramente dovuto a un posizionamento inadeguato da parte dell'esperimentatore, ripetere fino a tre volte nel tentativo di ottenere un punteggio superiore ai cinque secondi. Registrare o il tempo in cui il topo cade o il tempo fino a quando una delle quattro zampe tocca un pilastro, con un tempo massimo di prova di 30 secondi; prendere il miglior punteggio come dato per valutare la barra orizzontale. Se l'animale cade tra uno e cinque secondi, assegnare un punteggio pari a uno; tra sei e dieci secondi, assegnare un punteggio corrispondente.
Assegnare un punteggio di due tra 11 secondi e 20 secondi. Assegnare un punteggio di tre tra 21 secondi e 30 secondi. Assegnare un punteggio di quattro se si cade dopo 30 secondi o se si rimane semplicemente sulla barra fino a 30 secondi.
Assegna un punteggio pari a cinque, e il topo ottiene anch'esso un punteggio pari a cinque se tocca un'estremità. Fornire supporto tramite i suoi quattro arti in qualsiasi momento durante il test. Se si raggiunge un punteggio di cinque sulla barra da due millimetri, l'animale può quindi essere sottoposto a test su barre più spesse dopo una breve pausa.
Il sistema di punteggio per le barre di quattro e sei millimetri è lo stesso di quello per la barra di due millimetri, e il punteggio finale è la somma totale. Pertanto, un topo che ottiene un punteggio di cinque sulla barra di due millimetri ma cade dalla barra di quattro millimetri dopo 13 secondi, ottiene un punteggio pari a cinque più tre, cioè otto.
In questo test di coordinazione motoria, bacchette o aste di legno di diverso spessore, rispettivamente di 35, 28, 22, 15 e nove millimetri di diametro, ciascuna lunga 60 centimetri, sono fissate con una morsetto a G a una mensola del laboratorio posta a 60 centimetri dal pavimento. Viene tracciato un segno a 10 centimetri dall'estremità vicina al banco per indicare la linea di arrivo. Per iniziare, posizionare il topo all'estremità opposta dell'asta più larga, rivolto in direzione opposta alla mensola, e registrare il tempo necessario all'animale per orientarsi verso la mensola e il tempo totale di percorrenza.
Se il topo si capovolge e si aggrappa sotto la sbarra durante l'orientamento, assegnargli arbitrariamente il punteggio massimo di 120 secondi. L'animale non viene sottoposto ai test sulle altre sbarre e riceve anche un valore massimo di transito. Se il topo cade o raggiunge il tempo massimo di prova di 120 secondi dopo essersi orientato, non sottoporlo ai test su sbarre più strette.
Viene assegnato anche il punteggio massimo se il topo si capovolge mentre percorre la sbarra dopo l'orientamento; riportare il topo nella gabbia di provenienza e permettergli di riposare prima del test. La sbarra successivamente più piccola. Posizionare l'animale sulla sbarra più piccola come mostrato in precedenza.
Se il topo cade prima di cinque secondi, rimetterlo in posizione e consentire fino a due tentativi aggiuntivi. Registrare il tempo necessario per invertire la posizione sul bastone o fino a quando il topo cade. Per predisporre le sbarre parallele, posizionare due bastoni lunghi un metro e con un diametro di quattro millimetri, distanti tra loro 30 millimetri, su un supporto di legno.
Colonne a 60 centimetri dal pavimento. Posizionare il topo al centro delle due sbarre con l'asse longitudinale perpendicolare alle sbarre. Entrambe le zampe anteriori devono trovarsi su una sbarra e entrambe le zampe posteriori sull'altra sbarra.
La valutazione è simile a quella per le sbarre statiche. Vengono rilevate due misure: il tempo necessario affinché il topo si orienti a 90 gradi rispetto alla posizione iniziale e il tempo necessario affinché raggiunga uno dei supporti terminali. Analogamente, l'orientamento e il transito devono essere raggiunti senza che l'animale si capovolga; in caso contrario, viene assegnato il tempo massimo.
Se l'animale cade prima di cinque secondi, ciò è probabilmente dovuto a un posizionamento inadeguato e l'animale deve essere sottoposto nuovamente al test. Un'asta statica è stata inizialmente utilizzata per monitorare l'evoluzione della malattia in topi mutanti con o senza arricchimento ambientale nelle loro gabbie di mantenimento. Il programma di arricchimento ha ritardato in modo significativo l'insorgenza della disfunzione motoria sull'asta, fenomeno che è stato accompagnato da un ritardo nell'insorgenza del serramento scorretto degli arti posteriori.
Un segno generale di alterazione neurologica nei topi infetti è stato un calo delle prestazioni nel test della sbarra orizzontale a partire dalla settimana 16 dopo l'iniezione, nel test del rotorod a partire dalla settimana 18 e nei test delle sbarre statiche a partire da almeno la settimana 19. Le lesioni dell'ippocampo non hanno avuto alcun effetto su nessuna misura della capacità motoria, ma i topi SV 1 2 9 mostravano un deficit rispetto alla linea C 57 black six nel test del rotorod e delle sbarre statiche dopo lo sviluppo della malattia. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello studio degli effetti dell'arricchimento ambientale nei topi mutanti per la malattia di Huntington.
Panoramica
In questo articolo vengono presentati protocolli per la valutazione della coordinazione motoria nei topi mediante diverse prove, tra cui il test del rotarod accelerante e il test della sbarra orizzontale. Inoltre, vengono introdotte due prove recentemente sviluppate, sbarre statiche e sbarre parallele, che possono identificare deficit motori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi Comportamentale
- Coordinamento Motorio
Sfondo
- La coordinazione motoria è fondamentale per comprendere diverse condizioni neurologiche.
- Test consolidati come il rotarod sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca.
- Nuovi test sviluppati a Oxford mirano a potenziare il rilevamento dei deficit motori.
- Questi test possono inoltre fungere da variabili in studi comportamentali più ampi.
Scopo dello studio
- Misurare la coordinazione motoria nei topi utilizzando protocolli consolidati e nuovi.
- Identificare potenziali deficit motori in soggetti sperimentali.
- Fornire un approccio standardizzato per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Test del rotarod accelerato per valutare la presa e l'equilibrio.
- Test della sbarra orizzontale per la forza e la coordinazione degli arti.
- Test dei bastoncini statici per valutare l'orientamento e l'equilibrio.
- Test delle sbarre parallele per misurare la coordinazione motoria generale.
Risultati principali
- I risultati indicano livelli variabili di coordinazione motoria tra i topi sottoposti a test.
- Le metriche di prestazione forniscono informazioni su potenziali deficit.
- I nuovi test mostrano potenzialità nel rilevare deficit motori sottili.
- I protocolli standardizzati facilitano la riproducibilità nella ricerca.
Conclusioni
- Lo studio delinea con successo metodi per la valutazione della coordinazione motoria.
- Sia i test consolidati che quelli nuovi si rivelano efficaci nell'identificare alterazioni motorie.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi protocolli per esplorare condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione della coordinazione motoria nei topi è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione del target nella scoperta di farmaci in neuroscienze, assicurando che i fenotipi comportamentali osservati riflettano effettive variazioni cognitive o emotive piuttosto che deficit motori confondenti. Test motori standardizzati permettono di ottenere una previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta, isolando la funzione motoria come variabile indipendente, sostenendo decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di validazione del target. Questi saggi garantiscono una continuità traslazionale dall'interazione con il target allo screening fenotipico, riducendo l'abbandono in fasi avanzate dovuto a effetti collaterali motori inattesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche dissociando il deficit motorio da fenotipi cognitivi o emotivi in modelli mutanti o lesi.
- Valore operativo: Permette un'analisi selettiva dei fattori di confondimento motori in saggi comportamentali come il labirinto acquatico di Morris, migliorando l'interpretazione dei dati.
- Valore strategico: Favorisce la riduzione del rischio associato al target dimostrando che i fenotipi osservati non sono secondari a un malfunzionamento motorio, aumentando la fiducia nell'associazione tra target e meccanismo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi confermando la competenza motoria di base prima dei test cognitivi.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi e riproducibili (ad esempio, velocità di caduta sul rotarod, tempo di presa sulla sbarra orizzontale), consentendo la standardizzazione del saggio tra diversi siti.
- Valore strategico: Permette la valutazione scalabile di composti assicurando che le prestazioni motorie non interferiscano con i risultati di risposta alla dose o di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie rilevando deficit motori in modelli della malattia di Huntington e di altre condizioni neurodegenerative.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo il monitoraggio longitudinale del declino motorio.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio identificando precocemente segnali di alterazioni motorie nella fase di scoperta.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla selezione preclinica, in cui la coordinazione motoria funge da filtro critico per i fattori di confondimento prima della valutazione di endpoint cognitivi o emotivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando la funzione motoria come variabile indipendente, chiarificando se i fenotipi osservati derivino dall'interazione con la molecola bersaglio o da tossicità motoria.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante la validazione delle capacità motorie, riducendo i falsi negativi negli screening comportamentali dovuti a scadenti prestazioni motorie.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative (velocità di caduta dal rotarod, durata della presa sulla sbarra) che consentono confronti oggettivi tra diversi genotipi, trattamenti o punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando il declino motorio progressivo nei modelli di malattie neurodegenerative, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità piattaforma riutilizzabile in diversi progetti di neuroscienze, standardizzando la valutazione motoria tra diverse classi di bersagli e modalità.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei fenotipi comportamentali, assicurando che gli effetti osservati siano specifici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie a protocolli definiti, parametri di accelerazione e sistemi di valutazione uniformi tra le diverse modalità di test.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni più precoci di prosecuzione o interruzione, riducendo gli investimenti su bersagli con fenotipi confusi da alterazioni motorie.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta per rischio identificando alterazioni motorie che potrebbero compromettere la traslabilità clinica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroscienze comportamentali e manipolazione di roditori per garantire un posizionamento corretto e ridurre al minimo gli artefatti indotti dal posizionamento.
- Si basa su strumentazione calibrata (ad esempio, rotarod con controllo preciso della velocità, apparato con sbarra orizzontale a tensione regolata).
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi sperimentali per quanto riguarda i periodi di acclimatazione (5–20 minuti), le regole di ripetizione delle prove e i criteri di valutazione, al fine di assicurare la comparabilità dei dati.
- Comporta considerazioni relative all'adattamento tra diversi sistemi modello, poiché le differenze tra ceppi (ad esempio, C57BL/6 vs. SV129) e la variabilità legata al sesso influenzano le prestazioni motorie di base.
- Presenta limitazioni pratiche, come la suscettibilità al bias introdotto dall'esperimentatore durante il posizionamento, in particolare nelle prime prove, richiedendo protocolli di ripetizione e l'esclusione di valori anomali.
