Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Questo protocollo illustra come ottenere immagini di eventi dinamici nelle prime fasi di sviluppo degli embrioni di CL egan utilizzando ottiche DIC Norky o la fluorescenza, sfruttando microscopi comunemente disponibili e software open source. Il protocollo inizia descrivendo come dissezionare gli embrioni di CL gans e montarli per l'acquisizione delle immagini. Successivamente, viene illustrata la corretta configurazione delle ottiche DIC con maschera Norky per garantire immagini ottimali con il massimo dettaglio.

Viene inoltre esaminata la calibrazione dell'illuminazione epi fluorescente a campo largo e dell'illuminazione per raccogliere buoni dati di immagini fluorescenti, utilizzando software open source. Una buona microscopia permette di visualizzare la dinamica cellulare in un embrione in via di sviluppo. Le illustrazioni visive di questo metodo sono fondamentali, poiché configurare correttamente la D iic Optics è complesso, dato che la terminologia può risultare confusa e la tecnica corretta è difficile da descrivere per iscritto.

Inoltre, i ricercatori dovrebbero prestare attenzione a minimizzare l'esposizione alla luce durante l'acquisizione di immagini fluorescenti. Per limitare la fototossicità e il fotobiancamento, per preparare gli embrioni all'acquisizione di immagini, preparare innanzitutto due soluzioni di montaggio: una è vaselina fusa e l'altra è aros al due-tre percento in tampone.

È possibile preparare aros più densi se le strutture da osservare sono molto fragili, avendo cura di evitare l'ebollizione. Le due soluzioni stock vengono fuse nel microonde e quindi conservate in aliquote da quattro-cinque millilitri. Nel giorno dell'analisi, sciogliere un'aliquota di soluzione di Vaseline in un blocco termico a 65-70 gradi Celsius e sciogliere un' altra aliquota di soluzione di arose nel microonde.

Di nuovo, evitando il bollore. Successivamente, per mantenere queste soluzioni fuse, conservarle in un blocco riscaldante. Poi, coprire la parte superiore e inferiore di due vetrini con una striscia di nastro da laboratorio e posizionare un vetrino pulito tra i due vetrini nastroati.

Ora applicate alcune gocce dell'aros fuso su un vetrino pulito e coprite con un altro vetrino pulito. L'Aros si espande formando una matrice quadrata sottile insieme alla matrice per i vermi preparata. Utilizzate un microscopio stereoscopico e un bastoncino di platino per trasferire due vermi adulti in una goccia di tampone di nove-dodici microlitri su un coprioggetto di 18 per 18 millimetri.

Quindi tagliare. Aprire i vermi con un ago o un bisturi per liberare gli embrioni con il lato in agarro rivolto verso il basso. Posizionare la guarnizione per vermi sul coprioggetto di 18 per 18 millimetri e rimuovere con un rasoio qualsiasi agarro in eccesso.

Infine, per sigillare il vetrino, applicare la soluzione fusa di vaselina lungo il suo perimetro con un pennello o uno stuzzicadenti. Le cellule sono ora pronte per l'acquisizione delle immagini. Quando si posiziona il vetrino sul microscopio, assicurarsi che i due polarizzatori siano allineati perpendicolarmente l'uno rispetto all'altro.

Assicurarsi che sia i diaframmi sia i prismi siano fuori dal percorso del raggio luminoso. Se il campo non è scuro, ruotare il polarizzatore al di sotto del condensatore finché non lo diventa. Individuare gli embrioni utilizzando l'obiettivo 10 volte.

Cercare vicino ai corpi del verme gruppi di embrioni giovani per ottenere più embrioni all'interno del campo di imaging. Evitare gli embrioni all'interno del verme per ottenere le migliori immagini. Una volta individuati i migliori embrioni, passare a un obiettivo con ingrandimento maggiore.

Ora passare al cubo filtro DIC. Successivamente, inserire il prisma walstone superiore dell'obiettivo nel percorso della luce e ruotare la ghiera sul condensatore per selezionare il prisma walstone inferiore corrispondente all'obiettivo. Con i prismi posizionati, regolare lo scorrimento sotto questa torretta in modo da abbinare l'apertura numerica della lente.

Per ottenere un'illuminazione Köhler ottimale, mettere a fuoco il condensatore finché il bordo del diaframma del condensatore non appare più nitido. Il massimo della nitidezza corrisponde al momento in cui il confine tra la luce e il nero è più definito o a fuoco. Per ottenere un contrasto ottimale, regolare l'apparecchio a muro e il prisma ruotando la manopola sul cursore.

Ora il microscopio è quasi pronto per l'uso. È il momento di regolare ulteriori parametri di acquisizione immagini sul computer mediante il software open source Micro-Manager. Iniziare impostando il guadagno della fotocamera a zero.

Quindi passare al salvataggio dei file come tiff a otto bit, invece che a 16 bit. I file TIFF possono successivamente essere analizzati mediante software open source come Image J. Successivamente, regolare il livello di luce in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto dei livelli di saturazione. Se tutto è stato eseguito correttamente, l'immagine avrà un aspetto tridimensionale, con la luce che sembra provenire da un angolo.

Ora che l'immagine appare eccellente, selezionare gli embrioni da acquisire e disegnare una regione di interesse. Se il microscopio è dotato di motore di messa a fuoco, utilizzarlo per acquisire più piani focali a ogni tempo. Aprire la finestra di acquisizione multidimensionale e impostare i piani superiore e inferiore dello stack Z regolando la manopola di messa a fuoco per individuare il primo e l'ultimo piano focale in cui si vedono granuli di tuorlo ben messi a fuoco.

Impostare l'incremento. Questo definirà il numero di piani focali acquisiti. Ora, impostare un intervallo di tempo sufficientemente lungo da permettere l'acquisizione di tutti i piani focali.

È possibile impostare i punti temporali massimi molto elevati, in modo che il software acquisisca immagini fino a quando non viene arrestato manualmente. Impostare il software in modo che visualizzi solo l'ultima immagine acquisita, in modo da poter monitorare il processo. Assegnare ora un nome file alle immagini e iniziare l'acquisizione.

L'analisi delle immagini verrà brevemente rivista alla fine della prossima sezione. La costruzione di un filmato GFP è molto simile alla realizzazione di quattro D nor Musky DIC, ma si utilizza un file di configurazione che include il controllo software dello shatter fluorescente. Una volta localizzati gli embrioni, assicurarsi che il prisma walstone superiore non sia nel percorso della luce e commutare il cubo filtro su F-I-T-C-G-F-P.

Se questa impostazione non è stata attivata automaticamente all'avvio tramite il software, assicurarsi che il guadagno della telecamera sia impostato a 255. Il file immagine deve essere in formato tiff a 16 bit. Ora spegnere la sorgente di luce trasmessa e fare clic su acquisizione in tempo reale.

Regolare l'intensità della sorgente di luce UV e il tempo di esposizione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore per il segnale di fluorescenza; tuttavia, mantenere l'esposizione alla luce al minimo per preservare le cellule. Successivamente, impostare l'intervallo temporale. Il numero di punti temporali e il numero di piani focali procedono quindi con l'acquisizione delle immagini come descritto in precedenza.

Per analizzare i filmati, utilizzare un software open source. ImageJ con il plugin micromanager installato. I filmati molto grandi possono essere importati anche in ImageJ utilizzando il plugin loci. Questo è un embrione di tipo selvatico acquisito con ottica DIC senza maschera.

La parte posteriore è in basso a destra e quella ventrale è in basso a sinistra. Il filmato mostra una sequenza di immagini a singolo piano focale acquisite ogni 15 secondi. La riproduzione è impostata a 14 fotogrammi al secondo.

Questo embrione esprime fluorescenza durante la prima divisione embrionale; qui, la parte posteriore si trova in alto a destra. Questo filmato mostra i cambiamenti in un singolo piano focale ogni 10 secondi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare l'immagine di embrioni vivi utilizzando sia l'ottica DIC Naski sia la fluorescenza in epifluorescenza per studiare eventi dinamici.

Speriamo che ora abbiate una comprensione migliore di come configurare l'ottica DIC Nomar per ottenere immagini ottimali e che siate consapevoli di poter acquisire dati fluorescenti di alta qualità utilizzando l'illuminazione in fluorescenza in epifluorescenza, senza dover dipendere sempre da microscopi più avanzati. Potete inoltre applicare queste tecniche di imaging per esaminare embrioni privi della funzione di geni specifici, al fine di approfondire i requisiti genetici degli eventi di vostro interesse durante la divisione cellulare o lo sviluppo.