Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Questa procedura analizza gli effetti delle piccole GTPasi ACE sul traffico membranare polarizzato. Innanzitutto, iniettare contemporaneamente plasmidi di DNA che codificano per la piccola GTPasi ACE e per le proteine reporter nei nuclei cellulari di cellule polarizzate. Successivamente, esprimere il DNA a temperature che arrestino le proteine reporter nel reticolo endoplasmatico o nell'apparato di Golgi trans (TGN), mentre la piccola GTPasi si accumula nel citosol, quindi procedere con il chase della proteina reporter verso la superficie cellulare in presenza di cicloeside per prevenire ulteriore sintesi proteica.

Infine, etichettare la proteina reporter sulla superficie cellulare per l'analisi di immunofluorescenza. I risultati ottenuti con questo saggio permettono la visualizzazione del cambiamento nella localizzazione superficiale mediante microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasfezione è che, durante i brevi periodi di sovraespressione ottenuti con microiniezione, gli effetti secondari sono minimi, consentendoci di studiare gli effetti primari delle proteine di interesse.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della polarità cellulare, ad esempio in che modo le piccole gtpasi regolano il traffico di membrane polarizzato. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i singoli passaggi necessari per un microiniezione riuscita sono difficili da spiegare senza l'ausilio di supporti visivi. Isolare il DNA plasmidico privo di endotossine utilizzando il kit Sigma Aldrich per preparazioni massive prive di endotossine, seguendo il protocollo del produttore. Per questo esperimento, utilizzare tre filtri transwell trasparenti da 12 millimetri con pori di 0,4 micrometri per la coltura.

Le cellule vengono seminate quattro volte dieci alla quinta cellule MDCK su ciascun filtro. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio per verificare che le cellule stiano crescendo in un monolayer chiuso. Per la microiniezione.

Il giorno della microiniezione, preparare piastre da 360 per 15 millimetri contenenti cinque litri di terreno di crescita MM più 15 millimoli di heis e posizionarle in un incubatore a 39 gradi Celsius. Inoltre, preparare tre piastre a 12 pozzetti contenenti un millilitro di terreno di crescita MEM più 50 millimoli di heis e 0,1 milligrammi per millilitro di cicloesimide e posizionarle in un incubatore a 31 gradi Celsius. Accendere il microscopio per microiniezione, configurato con questo microscopio invertito dotato di piatto riscaldato, obiettivi 10x e 32x e un einor femto jet.

Impostare il palco riscaldato a 39 gradi Celsius. Aprire anche la fornitura di azoto gassoso al tavolo antivibrazioni. Diluire ora il DNA con acqua filtrata fino a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro.

Successivamente, centrifugare il DNA in una microcentrifuga einor a 13.000 giri al minuto per 30 minuti. Rimuovere la porzione superiore e trasferirla in un nuovo tubo. Successivamente, preparare le cellule MDCK estraendo il primo filtro dalla sua piastra di coltura con una lama chirurgica, tagliando il filtro dal suo supporto e posizionandolo nella piastra preparata da 60 per 15 millimetri contenente cinque millilitri di terreno di crescita MEM riscaldato a 39 gradi Celsius, integrato con hepes 50 millimolare.

Per tenere premuto il filtro nella piastra di coltura, posizionare la lama chirurgica al centro del filtro e quindi trasferire la piastra di coltura sullo stadio riscaldato del microscopio. Caricare da due a tre microlitri del DNA diluito in un ago da microiniezione. Ruotare il coperchio protettivo dell'ago e lasciarlo cadere a terra.

Per posizionare l'ago nel supporto, premere il tasto menu dell'inject e assicurarsi che la valvola sia chiusa. Avvitare l'ago nel suo supporto. Attenzione a non avvitare l'ago troppo stretto.

Poiché ciò potrebbe causare rotture, premere nuovamente il tasto del menu. In questo modo, la pressione di compensazione applicata impedirà al mezzo di essere aspirato all'interno dell'ago durante la procedura di microiniezione. Infine, premere il joystick per cancellare il posizionamento memorizzato e abbassare l'ago sulle cellule.

Utilizzare l'obiettivo 10x e portare l'ago nel fascio di luce sopra il liquido. Ora mettere a fuoco le cellule. Nuovamente mettere a fuoco verso l'alto ruotando la manopola di messa a fuoco di 180 gradi verso l'alto e individuare l'ago.

Spostare lentamente l'ago a fuoco. Quindi portarlo nuovamente fuori fuoco. Procedere verso il messa a fuoco delle cellule ancora una volta.

Riportare l'ago a fuoco. Ripetere fino a quando l'ago tocca la superficie del mezzo, momento in cui si osserva un alone. Continuare fino a raggiungere il punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l'ago è ancora sfocato fuori dal piano focale.

Ora passare all'obiettivo 32x e trovare le impostazioni grossolane. Impostare il limite Z toccando la membrana apicale con la punta dell'ago e sottraendo circa 10 micrometri, poiché i nuclei si trovano approssimativamente a 10 micrometri sotto la membrana apicale.

Ora portare l'ago di alcuni micron fuori dal piano focale il più rapidamente possibile. Mirare con l'ago sopra il nucleo e premere e rilasciare il pulsante di iniezione del joystick. Iniziare a 95 PSI per trovare la pressione di iniezione corretta.

Se la pressione è troppo elevata, le cellule esplodono. Se la pressione è troppo bassa, persiste un punto bianco, ma non accade altro. Eseguire un'iniezione riuscita che comporti un cambiamento di fase senza variazione della dimensione cellulare.

Iniettare da 100 a 500 cellule all'interno del foro della lama chirurgica che si trova sulle cellule. Successivamente, posizionare le cellule con la piastra di coltura e la lama chirurgica in un incubatore a 39 gradi Celsius e incubare per due ore. Infine, trasferire le cellule nella piastra a 12 pozzetti preparata con un millilitro di MEM più 50 millimolari di 0,1 milligrammi per millilitro di ciclo eide e incubare per due ore a 31 gradi Celsius.

Per evitare lo sbiancamento del segnale GFP espresso, proteggere i campioni dalla luce coprendoli con della carta d'alluminio durante tutte le successive procedure di marcatura superficiale. Posizionare le cellule in una piastra di coltura su una piastra metallica posta sul ghiaccio e lavare. Una volta con PBS freddo più più, posizionare un pezzo pulito di paraform sulla piastra metallica sul ghiaccio e aggiungere gocce da 30 microlitri di un anticorpo che riconosce il dominio ecto della proteina di interesse.

Ora posizionare il filtro contenente le cellule al contrario sulla goccia e aggiungere alcune gocce di anticorpo sul retro del filtro. Incubare per un'ora sul ghiaccio. Lavare le cellule tre volte con PBS freddo di ghiaccio più più e fissare con paraformaldeide al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Procedere con il lavaggio delle cellule una volta con PBS più più ed equilibrare in PBS più più per cinque minuti. Incubare ora le cellule nel buffer bloccante permeabilizzante. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, diluire gli anticorpi primari uno a 200 nel BPB per rilevare la RAB GTPasi espressa, centrifugare per 10 minuti a 13.000 g, pipettare 30 microlitri della soluzione anticorpale su un vetrino pulito posizionato in una camera umida.

Posizionare le cellule sul filtro a testa in giù sulle gocce di anticorpo e incubare per un'ora. A temperatura ambiente, rimettere le cellule a testa in su in una piastra da 12 pozzetti e lavare cinque volte nell'arco di 30 minuti con BPB a temperatura ambiente dopo l'incubazione con gli opportuni anticorpi secondari, includendo un passaggio di lavaggio.

Immergere le cellule sul filtro tre volte in acqua deionizzata e posizionarle sul lato dritto su vetrini microscopici con 10 microlitri di mezzo di montaggio. Posizionare in alto un vetrino coprioggetto di 18 per 18 millimetri e, utilizzando fazzoletti di carta, premere delicatamente il coprioggetto sulle cellule. Infine, sigillare con smalto per unghie nell'iniezione fittizia contenente solo il plasmide che codifica per V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteina viene consegnata alla superficie basolaterale di cellule MDCK ben polarizzate, come indicato dalla colorazione superficiale rossa nelle cellule che non sono ben polarizzate.

Una parte della proteina di fusione GFP verrà consegnata alla membrana apicale. Se i campioni di controllo appaiono in questo modo, i dati non sono affidabili e l'esperimento dovrebbe essere ripetuto con cellule meglio polarizzate. Si noti che non tutta la proteina di fusione espressa viene consegnata alla membrana basolaterale durante l'incubazione a 31 gradi Celsius, come dimostrato dal marcato segnale verde intracellulare per la proteina totale. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede circa 10-12 ore dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico di membrane per esplorare le proteine regolatrici nelle cellule epiteliali polarizzate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere proteine in cellule epiteliali polarizzate utilizzando la tecnica di microiniezione.