Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

L'obiettivo generale del seguente esperimento è affinare l'espressione di GAL4 attraverso l'utilizzo di lipasi specifiche per tessuto con strumenti di conversione GAL80. Questo viene ottenuto generando una collezione di linee transgeniche di moscerini con trappole di enhancer Philippe e determinando il modello di espressione della lipasi nel sistema nervoso centrale (CNS) in ciascuna linea. Utilizzando un reporter GFP e immunocitochimica, i reporter GFP possono differenziare l'espressione gliale da quella neuronale, consentendo di incrociare l'espressione di GAL4 in linee di interesse, ovvero linee ET flip, nei moscerini contenenti uno strumento di conversione GAL80 nella progenie.

L'analisi clonale può essere utilizzata per studiare il perfezionamento dell'espressione di GAL4, come nell'occhio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che linee basate su tracciamento di enhancer, insieme a strumenti di conversione GAL80, possono essere utilizzate con una vasta collezione di alleli GAL4 già disponibili nella comunità scientifica che lavora con il moscerino. Inoltre, questo concetto può essere esteso ad altri organismi modello emergenti che utilizzano il sistema GAL4-UAS, come il pesce zebra.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la mappatura dei circuiti neurali alla base del comportamento. Sebbene questo protocollo dimostri l'uso della base flip in un sottoinsieme di cellule fotoricettori, il metodo intersezionale può essere applicato all'analisi di altri tessuti, inclusi tessuti non neuronali. Man mano che vengono caratterizzate ulteriori linee di lipasi con trappola di enhancer.

Gout quattro US è una tecnica importante ampiamente utilizzata dai biologi dello studio della Drosophila. Un inconveniente della maggior parte delle linee GAL quattro è che vengono espresse in modo troppo ampio per poter essere utilizzate nel mappaggio cervello-comportamento mediante i metodi con dita. Non è possibile regolare finemente l'espressione di GAL quattro nelle magliette di interesse prima di utilizzare un transgene ET flip per limitare parzialmente l'espressione delle linee GAL quattro.

È innanzitutto utile conoscere il profilo di espressione del transgene ET flip x due negli stadi tardivi di sviluppo delle larve e negli adulti, al fine di visualizzare l'espressione di flip a nel sistema nervoso centrale. Impostare un incrocio tra maschi portatori del transgene di interesse ET t flip X due e femmine vergini che contengono un reporter GFP per l'espressione di et flip. Raccogliere le larve di terzo stadio F1 in fase di erranza per la dissezione. Posizionarle in una capsula Petri pulita e rimuovere eventuali detriti con un pennello, quindi risciacquare la capsula una volta con PBS 1x.

Ora riempire la piastra con PBS freddo di ghiaccio in concentrazione una volta per anestetizzare le larve. Per accedere al sistema nervoso centrale di una larva, afferrare il gancio boccale con una pinzetta. Afferrare il cuticolo vicino alla sfera anteriore estendente e staccarlo all'indietro. Il sistema nervoso centrale rimane attaccato al gancio boccale insieme ad alcune altre strutture.

Ora, con una pinzetta, rimuovere tutte le strutture in eccesso che circondano il SNC durante la dissezione del SNC. Trasferirle singolarmente in una capsula di Petri Pyrex a tre scomparti riempita con PBS. Una volta dissezionati tutti i SNC, fissarli immergendoli completamente in 200 microlitri di PFA al 4% su ghiaccio.

Se un SNC galleggia, non è stato completamente pulito da tutti i tessuti circostanti. In tal caso, utilizzare una pinzetta per riimmergere nuovamente il SNC nel fissativo dopo 15 minuti di fissazione, lavare il tessuto 3 volte con PBS freddo di ghiaccio e quindi lavare il tessuto altre tre volte con PBT freddo di ghiaccio. Il tessuto è ora pronto per essere analizzato mediante imaging o etichettato con anticorpi, oppure può essere conservato in PBT a quattro gradi Celsius per un uso successivo.

Colorazione dalla stessa incrocio utilizzato per raccogliere larve, raccogliere gli adulti F1 prima della dissezione. Immergere da cinque a dieci moscerini e raffreddare nell'etanolo al 95% per 30 secondi per rimuovere la cera presente sulla superficie della cuticola. Per rimuovere l'etanolo, lavare gli adulti tre volte con PBS freddo ghiacciato al 100%, e dopo il terzo lavaggio, trasferirne uno in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS freddo ghiacciato al 100% per preparare un adulto per la dissezione.

Posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto e inserire un perno da minione a metà dell'addome. Iniziare la dissezione utilizzando la pinzetta per rimuovere le zampe. Successivamente, rimuovere il capo della cuticola fissando la testa ai propoditi ed estraendo contemporaneamente la cuticola da sotto l'occhio verso la parte superiore della testa.

Utilizzando con attenzione pinzette affilate, rimuovere i tessuti circostanti il cervello poiché questi tessuti presentano una forte autofluorescenza e fanno galleggiare il cervello durante la fissazione. Il cervello rappresenta solo una parte del sistema nervoso centrale adulto. L'altra parte è il cordone nervoso ventrale, o VNC, situato nel torace, che deve essere anch'esso dissezionato.

Per prima cosa, rimuovere il cuticolo toracico fissando la mosca alla base della zampa posteriore e staccando delicatamente il cuticolo toracico fino alla base del collo. In secondo luogo, per esporre il cordone nervoso ventrale, separare delicatamente le due metà del cuticolo toracico. In terzo luogo, rimuovere l'addome dal torace fissando alla base della seconda zampa e staccando l'addome dalla regione vicina al primo sterno addominale.

In quarto luogo, pulire il cordone nervoso ventrale (VNC) fissando la zona omerale e staccando delicatamente il tessuto circostante il VNC. Separare l'anello di tessuto connettivo che circonda la connessione cervicale e continuare a rimuovere il tessuto in eccesso mentre si preleva l'encefalo. Quindi trasferire encefalo e VNC, simili a pere, in una capsula Petri Pyrex da nove cm riempita con PBS freddo 1x mantenuto sul ghiaccio.

Per fissare i tessuti adulti, immergerli in PFA al 4% su ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, eseguire tre lavaggi con PBS freddo e tre lavaggi con PBT. I tessuti sono ora pronti per essere analizzati mediante imaging o etichettati con anticorpi per valutare con precisione l'espressione del transgene.

È utile etichettare il sistema nervoso centrale con marcatori neuronali o gliali per fornire un riferimento. Iniziare incubando il tessuto a quattro gradi Celsius durante la notte con anticorpi specifici per neuroni o glia. Il giorno successivo, lavare il preparato cinque volte con PBT e incubare con l'anticorpo secondario fluorescente a temperatura ambiente per due ore. Avvolgere la piastra con stagnola per evitare il fotoblecimento dell'anticorpo al termine dell'incubazione.

Lavare il preparato con PBS e montarlo integralmente su un vetrino. Utilizzare un anello di plastica OSHA per evitare che il tessuto venga schiacciato dal coprioggetto. Il sistema nervoso è ora pronto per essere esaminato al microscopio a fluorescenza per analizzare i modelli di espressione di GFP e LL.

Tipicamente vengono esaminati da tre a cinque replicati per determinare la riproducibilità del pattern di espressione di flip. Il pattern di espressione di flip nella linea flip può essere utilizzato insieme ad altri transgeni per modificare il modo in cui il represseore GAL4 GAL80 viene espresso. La modulazione dell'espressione del represseore GAL80 rappresenta un metodo efficace per apportare modifiche.

Nell'espressione GAL quattro, un metodo consiste nell'eliminare l'espressione di GAL 80 mediante il transgene; l'espressione di GAL 80 inattiva GAL quattro, che altrimenti indurrebbe la degenerazione oculare in tutta l'occhio. La linea ET flip hash 6 88 A viene utilizzata qui per valutare l'efficacia dello strumento di conversione GAL 80 in un sottoinsieme di fotoricettori nella progenie F1, confrontando il fenotipo oculare con quello dei ceppi parentali. L'eventuale comparsa di deformità oculari o depigmentazione conferma che il modello di espressione del flip è presente nei fotoricettori e che l'eliminazione di GAL 80 è avvenuta con successo.

Una strategia complementare e non ridondante consiste nell'inserire l'espressione di GAL 80 utilizzando la stessa linea di inversione di interesse. Questa strategia è molto simile all'altra, ma ora la pigmentazione e la degenerazione nei progeni F1 sono soppressi. In flip X due.

Espressione dei fotorecettori Una volta acquisita padronanza, la dissezione del sistema nervoso centrale può essere eseguita in circa cinque minuti negli adulti e un minuto nei larve, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare pinzette affilate per rimuovere la trachea e i tessuti circostanti sia negli adulti che nei larvi C e Ss. È fondamentale usare una piastra priva di fissativo per la dissezione. Attualmente, il trattamento termico (heat shock) viene utilizzato per generare cloni casuali.

Al contrario, l'enhancer trap flip permette di generare cloni riproducibili, semplificando l'analisi morfologica e comportamentale. Un altro punto di forza del metodo del dito è che è possibile restringere ulteriormente i modelli di espressione di GAL4 utilizzando ulteriori linee basate sull'enhancer trap flip e altre linee gal. Un limite della configurazione tubulin stop GAL80 è che alcune combinazioni di GAL4 ed effettori UAS, come LAG4 e UAS-KIR, non sono compatibili perché causerebbero la morte delle mosche.

Questo problema può essere facilmente superato utilizzando un effettore condizionale UAS, come UAS Shiri Ts, che permette di esaminare un comportamento a temperature restrittive, come previsto. Non tutte le linee di enhancer trap lipasi esprimeranno livelli di lipasi sufficientemente elevati da essere utili. Tuttavia, la tecnica del dito qui descritta fornisce un nuovo approccio ai ricercatori di drosophila per affinare l'analisi mosaicale, sia per circuiti dello sviluppo che per il comportamento.