Procedura per l'Ingegneria del polmone

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un tessuto polmonare in coltura che sia morfologicamente e fisiologicamente paragonabile al tessuto polmonare nativo. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando il cuore e i polmoni da un ratto adulto. Il passaggio successivo consiste nel cannuccolare l'arteria polmonare e la trachea e nel collegare i polmoni cannucciati a un biorreattore per la decellularizzazione.

Dopo la descelularizzazione e il risciacquo, il polmone viene trasferito in un bioreattore sterile per colture e preparato per il seeding. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'inoculare il comparto desiderato del polmone con una popolazione cellulare preparata. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la matrice extracellulare descelularizzata efficientemente ripopolata con cellule che esprimono marcatori specifici regionali del polmone, mediante microscopia a fluorescenza immunoistochimica.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la coltivazione di cellule polmonari in vitro è che le cellule mantengono fenotipi differenziati per un periodo prolungato, consentendone lo studio per diverse settimane all'interno di un substrato biologico tridimensionale. Per la decellularizzazione, i polmoni vengono collegati al cappuccio del biorreattore tramite la cannula vascolare, e il cappuccio viene collegato all'apparato di decellularizzazione. La bottiglia di vetro posizionata sopra i polmoni è tenuta ferma da un sostegno ad anello e da una pinza fissata.

A questo punto, il materiale cellulare può essere rimosso per produrre un impalcatura di matrice extracellulare, che può essere ripopolata con materiale cellulare. L'assemblaggio del bioreattore per la semina e la coltura del tessuto polmonare ingegnerizzato è mostrato in questo diagramma. Il connettore a baionetta della cannula tracheale si collega a un circuito respiratorio tra la riserva della trachea e la camera principale.

Il circuito respiratorio comprende due valvole unidirezionali. Le posizioni sono tali per cui il mezzo segue un percorso diverso in entrata e in uscita dal polmone. Un piccolo serbatoio è temporaneamente incorporato nella linea di perfusione per il seeding delle cellule endoteliali.

Una pompa pulsatile viene utilizzata per trasportare le cellule dal serbatoio al compartimento vascolare del polmone. La perfusione vascolare è garantita mediante una pompa a rulli. Il mezzo di coltura viene perfuso nell'arteria polmonare attraverso la cannula collegata, scorre attraverso la vascolarizzazione polmonare ed esce dalla vena polmonare direttamente nel bioreattore principale, dove il mezzo viene aspirato per la perfusione.

L'epitelio polmonare viene posizionato mediante iniezione nel circuito respiratorio. La camera principale contenente il polmone e la riserva di trachea viene utilizzata per la coltura polmonare a lungo termine. Dopo l'estrazione dei polmoni e la corretta canulazione dell'arteria e della trachea, i polmoni appena estratti dovrebbero trattenere l'aria senza perdite.

Questo può essere verificato gonfiandoli con aria mentre sono immersi in un liquido. Non devono essere presenti bolle che indichino perdite d'aria. Per iniziare il protocollo, i polmoni vengono gonfiati con PBS contenente nitroprussiato di sodio fino a quando non sono pieni, ma non sovragonfiati; immediatamente si chiude il cannula tracheale in modo che i polmoni rimangano gonfi.

Successivamente, perfondere i polmoni con PBS e SNP per almeno 15 minuti a 15 millimetri di mercurio. Dopodiché, rimuovere il tappo dalla cannula tracheale per permettere ai polmoni di sgonfiarsi. Continuare la perfusione con PBS e SNP per 15-30 minuti, se necessario.

Riempire nuovamente con PBS e SNP per garantire che la pressione di perfusione sia mantenuta tra 10 e 15 millimetri di mercurio. Per iniziare la procedura di decellularizzazione prolungata, il cappuccio del bioreattore viene collegato all'apparato di decellularizzazione. Successivamente, i polmoni vengono collegati al cappuccio.

Utilizzando i collegamenti a bloccaggio dell'esca collegati alla cannula a forma di YS, la cannula dell'arteria polmonare deve essere connessa alla linea di perfusione, mentre la cannula tracheale deve rimanere libera. Per garantire una completa descellularizzazione del tessuto, è fondamentale mantenere l'aria fuori dal sistema. Le valvole unidirezionali presenti nella cannula arteriosa e in quella tracheale contribuiscono a rimuovere le bolle d'aria dai tubi consentendo un flusso inverso all'interno dei tubi stessi.

Pertanto, consentire la rimozione delle bolle d'aria mediante siringa, assicurarsi che tutte le linee siano libere da aria. Iniziare la perfusione con la soluzione di descellularizzazione. Perfuso con soluzione di descellularizzazione.

Fino a quando 500 millilitri di soluzione non sono perfusi attraverso i polmoni, la pressione ottimale è inferiore a 15 millimetri di mercurio. Ciò richiederà tipicamente 2,5 ore. Le velocità di flusso sono inizialmente molto lente e aumentano rapidamente durante la seconda ora fino a raggiungere circa un millilitro al minuto o superiore.

Durante la perfusione, rimuovere periodicamente il fluido di descellularizzazione dal bioricettacolo, assicurandosi che rimanga una quantità sufficiente di liquido per sostenere il polmone e la cannula tracheale. Al termine della perfusione con il fluido di descellularizzazione, trasferire i polmoni e il bioricettacolo in una cappa a flusso laminare per colture cellulari. Per iniziare il risciacquo dell'organo, rimuovere il barattolo da 500 millilitri contenente il fluido di descellularizzazione e sostituirlo con un barattolo sterile contenente fino a un litro di PBS sterile.

Utilizzare l'aspirazione a vuoto o una siringa per assicurarsi che i tubi siano privi di aria ed eseguire la perfusione di PBS attraverso la vascolarizzazione a 10-15 millimetri di mercurio, nello stesso modo. Per quanto riguarda la descellularizzazione, utilizzando tecniche sterili, rimuovere periodicamente il PBS di scarto dal biorreattore e sostituire o riempire il contenitore di PBS. Continuare a lavare con PBS fresco e sterile fino a quando almeno 2,5 litri di PBS sterile non abbiano perfuso i polmoni.

Questo richiederà tipicamente due giorni a partire dall'inizio del processo di descellularizzazione, una volta completato il risciacquo. Trasferire i polmoni in un nuovo sistema di bioreattore sterile contenente PBS fresco più 10% FBS più 10% Pen strep, assicurandosi che sia l'intero circuito di perfusione sia l'intere linee delle vie aeree siano riempite di liquido. Da questo momento in poi verrà utilizzata una pompa pulsatile per perfondere i polmoni a cinque millimetri al minuto.

Sterilizzare lo scaffold della matrice extracellulare polmonare mediante perfusione notturna con PBS contenente 10% di FBS e 10% di penicillina-streptomicina. Al termine di questo passaggio, trasferire i polmoni in un incubatore a 37 gradi Celsius per un'ora o fino al raggiungimento dell'equilibrio termico. In preparazione al trattamento con Ben Nase, il passaggio successivo consiste nel trattare i polmoni con Ben Nase.

Per rimuovere il DNA residuo da ciascun polmone, riempire prima una siringa da 10 millilitri solo con il buffer Prewarm Ben Nase e una siringa da 10 millilitri con 90 unità per millilitro di Ben Nase diluito nel buffer Ben Nase. Arrestare la perfusione dei polmoni.

Quindi gonfiare le vie aeree con il buffer Ben Nase evitando di iniettare aria nel polmone. Lasciare sgonfiare il polmone per un minuto. Successivamente, gonfiare il polmone con la soluzione Ben Nase.

Anche in questo caso, fare attenzione a non introdurre aria nel polmone dopo averlo gonfiato con Ben Nase. Lasciare i polmoni a riposo senza perfusione o ventilazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'ora, riprendere la perfusione con il PBS più 10% FBS e 10% penicillina-streptomicina già presente nel biorreattore e continuare la perfusione per tutta la notte fino al giorno seguente.

Dopo il risciacquo e la sterilizzazione, la lunga matrice extracellulare può essere preparata per la ripopolazione cellulare. Sostituire la soluzione di P-B-S-F-B-S benzo a con 250 millilitri di mezzo di coltura. Permettere la perfusione per almeno un'ora prima dell'introduzione delle cellule e sostituire con mezzo di coltura fresco immediatamente prima della semina delle cellule.

È possibile utilizzare diverse fonti cellulari per la rigenerazione degli organi. In questo caso, verrà dimostrato l'impiego di una popolazione di cellule epiteliali. Per prima cosa, preparare una siringa contenente 15 millilitri di una sospensione cellulare della popolazione desiderata di cellule epiteliali.

Successivamente, riempire il serbatoio dell'aria con 80 millilitri di mezzo di coltura e assicurarsi che tutte le linee di ventilazione siano libere da aria. Quindi posizionare il bioreattore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e collegare la pompa a siringa per la ventilazione. Seminare le cellule nei polmoni utilizzando un'unica iniezione rapida, iniettando la sospensione cellulare da 15 millilitri nella cannula tracheale.

Assicurarsi che i filtri dell'aria sul biorreattore principale siano chiusi. Quindi iniziare immediatamente un'unica inspirazione lenta utilizzando la pompa a siringa per prelevare 60 millilitri di aria dal biorreattore principale a una velocità di tre millilitri al minuto. Questa operazione durerà circa 20 minuti.

Lasciare i polmoni a riposo in modo statico per circa 18 ore dopo tale procedura. Iniziare la perfusione vascolare lenta a circa 0,5 millilitri al minuto. Durante la coltura dell'organo, la perfusione viene generalmente eseguita da uno a tre millilitri al minuto.

Utilizzando una pompa a rulli durante la coltura epiteliale, la ventilazione viene tipicamente fornita a un ritmo continuo di un respiro al minuto e con un volume corrente compreso tra cinque e dieci millilitri. Utilizzando una pompa per siringa, l'aria viene periodicamente aspirata e iniettata nel bioreattore per simulare la respirazione alternando tra pressione negativa e pressione atmosferica all'interno della camera principale. A causa della necessità di mantenere il bioreattore ermetico durante la ventilazione, la ventilazione deve essere sospesa quotidianamente e l'aria nella camera principale deve essere sostituita.

Inoltre, il mezzo dovrebbe essere cambiato circa ogni tre o quattro giorni. Durante la coltura, ogni volta dovrebbe essere scambiata circa la metà del volume totale mediante la coltivazione dell'epitelio polmonare e dell'endotelio vascolare. All'interno dello scaffold montato nel biorreattore, siamo in grado di generare tessuto polmonare capace di partecipare allo scambio gassoso per brevi intervalli di tempo.

Viene mostrata qui una colorazione standard ematossilina, eosina e eosina di un polmone di ratto nativo, a scopo comparativo con una colorazione ematossilina e eosina (H e E) di un polmone di ratto descellularizzato. La matrice extracellulare descellularizzata finale dovrebbe essere completamente priva di materiali cellulari e mantenere le caratteristiche macroscopiche, microscopiche e ultrastrutturali del polmone nativo. La colorazione H e E permetterà la visualizzazione di qualsiasi residuo di DNA aderente allo scaffold a causa di una descellularizzazione o di un risciacquo insufficienti, condizioni ottimali per la semina cellulare e la successiva coltura del polmone.

E il bioreattore dovrebbe produrre cellule ben distribuite all'interno di tutti e cinque i lobi del polmone e garantire una copertura di circa il 70% della matrice extracellulare. Queste immagini confrontano il polmone nativo con il polmone ripopolato, colorato mediante immunofluorescenza. Per i principali marcatori polmonari, la popolazione cellulare coltivata risulta positiva per la proteina segretoria delle cellule di Clara, la proteina segretoria pro C e l'acquaporina cinque.

I marcatori di interesse sono mostrati in rosso e i nuclei colorati con DAPI sono in blu in tutti i pannelli. Una volta padroneggiata questa procedura, dalla descelularizzazione al reimpiego, può essere completata in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente.