Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare l'efficienza di induzione cardiogeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare la regolazione temporale cruciale necessaria per la differenziazione dei cardiomiociti nelle cellule staminali embrionali murine. Questo viene ottenuto innanzitutto formando corpi embrionali in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo per standardizzare la formazione dei corpi embrionali come secondo passaggio. Modulatori proteici o chimici vengono aggiunti ai corpi embrionali seguendo un corso temporale predeterminato, che consentirà un controllo temporale dei percorsi in esame.

Successivamente, gli EBS contrattili vengono quantificati manualmente per determinare l'efficienza di induzione di diverse modalità di modulazione del segnale. I risultati ottenuti mostrano i requisiti temporali delle vie di segnalazione essenziali per la differenziazione dei cardiomiociti, basati sulla percentuale di EBS contrattili formati e confermati mediante il metodo della goccia sospesa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la goccia sospesa, è che standardizza e semplifica una procedura laboriosa e consente una lettura diretta per la quantificazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule staminali, ad esempio identificando la coagulazione dei segnali essenziali che indirizza la differenziazione verso il tipo cellulare desiderato. Per iniziare questa procedura, coltivare cellule staminali embrionali di topo in piastre da coltura cellulare da 10 centimetri con mezzo per cellule staminali embrionali di topo integrato con fattore inibitore della leucemia. Quando le cellule staminali embrionali raggiungono una confluenza del 50-70%, sono pronte per l'uso.

Rimuovere il mezzo ES e lavare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS sterile. Aggiungere due millilitri di tripsina 0,05% EDTA per ogni piastra e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Successivamente, neutralizzare la tripsina con EDTA aggiungendo tre millilitri di mezzo ES per ogni piastra e trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare a 1000 giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet cellulare con la quantità desiderata di mezzo EB. Contare il numero di cellule, quindi diluire le cellule a cinque per 10 alla tre cellule per millilitro.

Nel mezzo EB, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di mezzo EB contenente cellule in ogni pozzetto di una piastra microtitolatrice da 96 pozzetti a fondo rotondo. Il numero di piastre da 96 pozzetti necessarie dipenderà dal numero di condizioni e di punti temporali dell'esperimento. Posizionare le piastre microtitolatrici da 96 pozzetti a fondo rotondo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per identificare le finestre temporali critiche delle principali vie di segnalazione per la cardiogenesi.

Vengono aggiunti alle cellule ES modulatori di specifiche vie di segnalazione. Nelle piastre a 96 pozzetti rotondi, aggiungere il modulatore di segnalazione, diluito nel mezzo, in ciascun pozzetto in diversi punti temporali. Metà dei pozzetti di ciascuna piastra a 96 pozzetti viene utilizzata per ciascun punto temporale iniziale del trattamento.

Un controllo con veicolo viene aggiunto alle altre 48 pozzette per ciascun punto temporale. In diversi momenti di arresto, si procederà a rimuovere i modulatori del segnale da ciascuna pozzetta sostituendo il mezzo, prestando grande attenzione durante questa operazione per evitare di disturbare gli aggregati embrionali in diversi punti temporali di arresto. Rimuovere i modulatori sostituendo il mezzo degli aggregati embrionali per le pozzette. Inclinare la piastra a 96 pozzette di circa 10 gradi e rimuovere delicatamente il mezzo dalle pozzette utilizzando una pipetta multicanale.

Quindi aggiungere nuovamente il mezzo EB senza modulatore in ogni pozzetto per qualsiasi trattamento superiore a 48 ore. Cambiare il mezzo EB integrato con modulatori freschi ogni due giorni fino al tempo di arresto desiderato. Sette giorni dopo l'induzione degli EB mediante il trasferimento delle cellule ES in piastre a 96 pozzetti, esaminare la contrazione degli EB al microscopio.

Valutare i pozzetti con EBS che contraggono come positivi per ottenere le percentuali di EBS contrattili per ciascun diverso tempo di trattamento. Le finestre temporali di segnalazione per la cardiogenesi identificate negli esperimenti con piastre a 96 pozzetti possono essere verificate in EBS ottenuti da gocce sospese, preparando gocce di EB sospese. Preparare innanzitutto le piastre di Petri aggiungendo tre o quattro millilitri di PBS per prevenire successivamente l'aberrazione delle gocce.

Successivamente, una sospensione di cellule staminali embrionali preparata a una densità finale di 2,5 × 10⁴ cellule per millilitro viene versata in una piastra batteriologica per agevolarne l'accesso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere gocce da 20 microlitri di cellule staminali embrionali sui coperchi capovolti delle piastre di Petri. Assicurarsi che le singole gocce non entrino in contatto tra loro.

Generalmente, un coperchio può contenere fino a 80 gocce. Successivamente, capovolgere il coperchio sopra la piastra di Petri contenente il PBS e incubare per 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la formazione di corpi embrioidi (EB). Dopo 48 ore, lavare i corpi embrioidi formati dalle gocce sospese di ciascun coperchio con tre millilitri di mezzo EB.

Estrarre due coperchi di EBS e posizionarli in una nuova piastra di Petri. Incubare la piastra di Petri per quattro giorni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; al quarto giorno, trasferire gli EBS in sospensione su piastre da sei pozzetti rivestite con gelatina allo 0,2%, in generale. Trasferire 30 EBS in ogni pozzetto e incubare con modulatori del segnale nel periodo di tempo identificato negli esperimenti effettuati in piastre a 96 pozzetti, sette giorni dopo la formazione delle gocce sospese.

Osservare l'EBS al microscopio per la contrazione degli EB. Le cellule ES coltivate nei pozzetti rotondi di una piastra a 96 pozzetti formeranno corpi embrioidi (EBS), come mostrato in questa immagine rappresentativa di un EB formato al quarto giorno. I punti temporali critici per la cardio-genesi delle cellule ES sono le finestre temporali che contengono la percentuale più alta di EBS contrattili trattati con modulatori del segnale, rispetto al controllo con veicolo. Qui è mostrato un focolaio di contrazione spontanea di cardiomiociti derivati da cellule ES trattate con morfina dorsale al decimo giorno di differenziamento su una piastra microtitolata a 96 pozzetti.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare in modo efficiente la regolazione temporale critica e le finestre temporali dei principali percorsi di segnalazione nella cardio-genesi delle cellule staminali.