Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l'analisi delle interazioni proteina-lipide

Questo esperimento è progettato per identificare proteine leganti i lipidi e per analizzare l'interazione tra proteine e lipidi in un ambiente di membrana definito. Le proteine di lisati cellulari sono incubate con vescicole lipidiche appena preparate da fosfatidilserina e ceramide. La miscela di reazione viene quindi integrata con delle microsferette magnetiche coniugate a Xin V per ancorare le proteine associate alle vescicole lipidiche alle microsferette magnetiche. Successivamente, le vescicole lipidiche-proteina vengono purificate mediante il metodo di separazione cellulare attivata da campo magnetico.

Per identificare i risultati dimostrati della proteina legata al lipide, utilizzare la SDS-PAGE e il Western blotting per mostrare la purificazione di PKC atipica endogena e ricombinante e di un dominio specifico di legame alla ceramide espressi in cellule MDCK. Il principale vantaggio di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti come ELISA o la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie per il legame superficiale è che l'interazione tra lipide e proteina avviene in un ambiente simile a una membrana e che le proteine leganti possono essere purificate e analizzate. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi di malattie che coinvolgono i lipidi, poiché in queste patologie l'interazione fisiologica tra lipidi e proteine è compromessa.

Per alcune di queste malattie, le proteine bersaglio non sono ancora note e devono essere identificate. Per progettare una terapia basata sui lipidi, iniziare con sles lipidici preparati da una miscela essiccata di quantità equimolari di fosfatidilserina e ceramide C16 in 100 microlitri di buffer sical. Sonicare per un'ora dopo aver aggiunto 300 microlitri di buffer iCal, integrato con cloruro di manganese 0,1 millimolare; centrifugare i campioni a 12.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius, quindi risospendere il pellet di vescicole lipidiche grandi in 100 microlitri di buffer sical. Aggiungere un nanomolare di colorante fluorescente vibrant cm DII e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per facilitare la visualizzazione della frazione sles dopo la separazione massima; recuperare un pellet rosa di fosfato marcato con vibrant cm DII e sles di ceramide siriana mediante centrifugazione e risospendere in 100 microlitri di buffer tris.

Successivamente, per preparare un lisato cellulare privo di detergenti, sottoporre le cellule a sonica in 300 microlitri di tampone ipertonico contenente 10 millimolari di tris, cloruro di idrogeno, inibitori della proteasi e della fosfatasi, quindi centrifugare. Per rimuovere i detriti membranosi, aggiungere ora il lisato cellulare limpido alla sospensione fisica dei lipidi e incubare la miscela per due ore a quattro gradi Celsius. Poiché i lisati cellulari possono contenere membrane endogene con fosfato aerinico, si raccomanda di eliminare tali membrane dal lisato mediante ulteriori passaggi di centrifugazione.

Aggiungere alla miscela di reazione 20 microlitri di un buffer di legame XNV e 50 microlitri di una soluzione contenente microsferette magnetiche coniugate con XNV; incubare per un'ora a quattro gradi Celsius, quindi eseguire il sorting cellulare attivato magneticamente secondo le indicazioni del protocollo del produttore. Successivamente, monitorare la fluorescenza vivace di CM DII nelle frazioni di flusso e di eluizione utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre per determinare la presenza e la quantità di lesioni lipidiche in un saggio di competizione con anticorpi. Per verificare la specificità della reazione di legame della PKA per le vescicole di ceramide fosfo-serina, incubare un microgrammo di anticorpo policlonale da coniglio anti-PKC Zeta con un lisato cellulare per un'ora a quattro gradi Celsius, seguito dall'incubazione con le vescicole lipidiche.

Proseguire con SDS-PAGE e analisi di immuno-blotting della proteina legata al fosfato di serina ceramide nell'eluito massimo per la ricostruzione in vitro di un complesso di polarità lipide-proteina. Iniziare con la preparazione di pellet rosa di vescicole di fosfato di serina ceramide marcate con CM-DII brillanti, come mostrato in precedenza; risospendere le vescicole in 100 microlitri di buffer Tri, integrato con 100 micromolar di gamma-S-GTP, 1 millimolare di GDP e una combinazione di proteine ricombinanti di interesse. Incubare quindi la reazione a 4 gradi Celsius per tre ore. Successivamente, aggiungere 5 microlitri di una soluzione stock 20x di un buffer X in V e 50 microlitri di perle magnetiche coniugate con X in V.

Incubare la miscela sotto agitazione delicata per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius. Proseguire eseguendo la separazione magnetica di cellule attivata NX NV come raccomandato dal protocollo del produttore per favorire la precipitazione. Integrate la frazione di eluizione con 10 microgrammi di albumina e pura.

Concentrare le proteine mediante precipitazione con etere di petrolio. La fase inferiore è costituita da cloroformio e metanolo con cm dii arricchito. L'interfase brunastra contiene le perle magnetiche e le proteine precipitate.

Quantificare le vescicole lipidiche ellu mediante la rilevazione del colore rosa e brillante di cm dii nella fase organica di cloroformio-metanolo della reazione weyl flu. Utilizzare quantità uguali di vescicole lipidiche per normalizzare le quantità di proteina tra i campioni e analizzare mediante elettroforesi SDS-PAGE. Immunoblotting.

Un lisato privo di detergenti di cellule MDCK che esprimono la PKC Zeta a lunghezza intera, con il dominio C-terminale legato a una proteina fluorescente verde o a un dominio legante la ceramide. Il dominio C-terminale della PKC Zeta è stato incubato con fosfo serina.

Successivamente all'eluzione della colonna Max, le proteine sono state analizzate mediante immunoblotting. Il frammento legante la ceramide C20 Zeta, EGFP e la proteina PKC Zeta nella sua lunghezza completa sono stati recuperati dall'EIT della colonna Max, risultati coerenti con la specificità e l'efficacia della procedura lyx. Il controllo negativo EGFP, che non si è legato al fosfato, né alle nostre vescicole di ceramide siriana, non è stato rilevabile nell'EIT.

Quando Linx viene integrato con altri metodi come la SDS-PAGE e il western blotting o con analisi proteomiche, è possibile rispondere ad altre domande, come quali proteine siano presenti nel complesso proteico legante i lipidi. Dopo il suo sviluppo, LabX ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio dei singoli lipidi per esplorare l'apoptosi indotta da ceramide e la polarità cellulare nelle cellule staminali neurali e nelle cellule epiteliali.