High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

L'obiettivo generale di questa procedura è classificare il fosforo organico idrolizzato enzimaticamente negli estratti di campioni di suolo o letame. Questo viene ottenuto estraendo innanzitutto i campioni con una soluzione di idrossido di sodio ed EDTA e regolando il pH degli estratti. Successivamente, incubare questi estratti regolati con due diverse soluzioni enzimatiche.

In una piastra a 96 pozzetti, l'ultimo passaggio consiste nel misurare l'ortofosfato rilasciato dall'enzima mediante colorimetria con blu di molibdeno. In definitiva, la maggior parte delle forme native di fosforo monoesteri ortofosfato e di fosforo diesteri può essere classificata in campioni di suolo o letame sulla base del rilascio differenziale di ortofosfato ottenuto con il metodo di idrolisi enzimatica. Questo metodo può essere eseguito a basso costo in qualsiasi laboratorio standard.

Il vantaggio principale rispetto ai metodi esistenti, come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del fosforo-31, è che può misurare il potenziale degli enzimi endogeni del suolo di rilasciare ortofosfato da composti organici contenenti fosforo in futuro. Pertanto, i dati ottenuti con questo metodo possono contribuire a prevedere la fertilità del suolo o la capacità del suolo di rilasciare quantità dannose di ortofosfato disponibile per le alghe. Aggiungere 30 millilitri della soluzione di idrossido di sodio 0,25 molare a due grammi di campione umido o essiccato in un tubo conico da 50 millilitri.

Incubare con agitazione per 16 ore a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 3000 ×g per 30 minuti, quindi trasferire 100 microlitri in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro che contiene già tampone acetato. Il campione aggiustato ha un volume totale di un millilitro e un pH di 5,0.

Preparare due soluzioni stock contenenti 0,5 unità per millilitro di fosfatasi acida in 10 millilitri di acetato di sodio 0,1 molare appena preparato a pH 5. Aggiungere ora la nucleasi liofilizzata ricostituita NP1 da Penicillium Citrinum in uno dei due tubi da 10 millilitri di soluzione stock di fosfatasi acida fino a una concentrazione finale di 2,5 unità di NP1 per millilitro, mescolando delicatamente per inversione per diverse volte; centrifugare le due soluzioni enzimatiche a 3000 ×g per 30 minuti. Per costruire una curva di calibrazione, iniziare aggiungendo un millilitro di soluzione stock di fosfato di potassio 1 millimolare in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri ed eseguire sette diluizioni seriali di 0,5 millilitri, scartando il primo tubo, in modo che l'intervallo finale di diluizione vada da 20 µM a 0,625 nM di fosforo.

Ora trasferire gli standard di ORTOFOSFATO nelle ultime due colonne della piastra, iniziando con zero nm di ortofosfato nella riga A e terminando con 20 nm di ortofosfato nella riga H nei primi tre pozzetti della colonna 10. Aggiungere 40 microlitri di soluzione enzimatica PP più GP nei successivi tre pozzetti della colonna 10. Aggiungere 40 microlitri di soluzione enzimatica PP più GP più NP uno.

Infine, aggiungere 40 microlitri di tampone acetato 100 millimolare in tutte e sei le pozzette. Ora ciascuna delle prime sei pozzette della colonna 10 deve contenere 80 microlitri di soluzione nelle due pozzette successive. Aggiungere 40 microlitri di soluzione di acetato di sodio contenente glucosio 10 M, sei fosfato e 40 microlitri di soluzione enzimatica PP più GP.

Per ogni campione in fase di analisi, distribuire 40 microlitri di estratti di campione a pH regolato nelle pozzette da uno a nove in fino a otto righe, dopo aver distribuito tutti i campioni. Utilizzare una pipetta multicanale per distribuire la soluzione enzimatica PP più GP nelle colonne da uno a tre, PP più GP più NP nelle colonne da quattro a sei e tampone acetato di sodio 0,1 molare nella colonne da sette a nove. Eseguire rapidamente questo passaggio per assicurare che tutti i campioni ricevano un tempo di incubazione equivalente.

Coprire la piastra a 96 pozzetti con un coperchio e incubare campioni, soluzioni enzimatiche, controlli e curva di calibrazione esattamente per un'ora a 37 gradi Celsius in acqua deionizzata. Preparare 50 millilitri di ciascuna delle quattro soluzioni stock. La soluzione A deve essere preparata giornalmente utilizzando una pipetta multicanale in modo rapido.

Aggiungere 25 microlitri di SDS, 100 microlitri di soluzione A, 20 microlitri di soluzione B e 50 microlitri di soluzione C in tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Infine, misurare l'assorbanza a 850 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre regolabile in qualsiasi intervallo con un'applicazione per fogli di calcolo.

Per prima cosa, tracciare la curva di calibrazione del fosforo inorganico con valori da zero a 20 nanomoli di fosforo sull'asse X e la media delle misure duplicate di assorbanza sull'asse Y, eseguire una regressione lineare e determinare l'equazione della retta di migliore adattamento. Successivamente, calcolare il fosforo inorganico di fondo facendo la media dei valori delle colonne da uno a tre, quindi applicare la curva di calibrazione al set di dati. Per determinare il fosforo derivato dagli esteri mono del fosforo idrolizzati, fare la media dei valori triplcati dei campioni delle colonne da quattro a sei e sottrarre la soluzione controllo dell'enzima più il fosforo inorganico di fondo.

Quindi, per calcolare il contenuto di fosforo a partire dal fosforo idrolizzato, i DER calcolano la media dei valori delle tre repliche del campione nelle colonne da sette a nove e sottraggono la soluzione enzimatica di controllo più il fosforo inorganico di fondo più il fosforo degli esteri mono idrolizzati delle colonne da quattro a sei. Una piastra tipica a 96 pozzetti mostra i risultati per otto campioni e una curva di calibrazione. I controlli si trovano nella colonna 10.

L'aumento dell'intensità del colore tra le colonne da uno a tre e da quattro a sei è dovuto ai composti di fosforo monoestere idrolizzati; tra le colonne da quattro a sei e da sette a nove è dovuto ai composti di fosforo diestere idrolizzati. In questo caso, il metodo dell'idrolisi enzimatica ad alto rendimento è stato utilizzato per analizzare con successo la distribuzione delle classi di fosforo in estratti di un campione di suolo del Vermont contenenti idrossido di sodio 0,25 molare ed EDTA 0,05 molare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare i composti nativi di ortofosfato, monoestere e diastere del fosforo in estratti di suolo o letame mediante idrolisi enzimatica.

Questa tecnica potrebbe aiutare a tracciare la strada per i ricercatori nei campi della chimica ambientale e della gestione dei nutrienti, consentendo di esplorare il comportamento del fosforo organico in sistemi di suolo o letame.