Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

La ionizzazione secondaria mediante spruzzo elettrostatico, la spettrometria di massa o CS EMS permettono l'analisi dei composti volatili batterici senza necessità di alcun trattamento preliminare del campione. Lo spazio di testa della coltura batterica viene spostato mediante anidride carbonica nella camera di reazione cssi. Mentre i composti volatili attraversano la camera di reazione SSI, passano attraverso la nube di spruzzo elettrostatico e vengono ionizzati.

Dopo essere stati ionizzati, i composti volatili vengono aspirati nello spettrometro di massa per l'analisi. L'eccesso di gas trasportatore e i volatili batterici non reattivi vengono fatti passare attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere eventuali agenti batterici, come ulteriore misura di protezione, e scaricati in una cappa chimica. In definitiva, questo protocollo CSI MS consente di ottenere impronte volatili batteriche in pochi minuti.

Prevediamo che questa tecnologia potrebbe essere utilizzata in molteplici applicazioni, inclusa l'analisi dell'aria espirata per malattie infettive, o addirittura applicata ai sistemi alimentari, dove potremmo essere in grado di rilevare rapidamente patogeni presenti sugli alimenti o al loro interno. Questa tecnica presenta diversi vantaggi principali rispetto ai metodi esistenti come GCMS, MS e PT, RM S: innanzitutto, i composti volatili non richiedono alcun pretrattamento prima dell'analisi.

In secondo luogo, è possibile frammentare ioni specifici nella miscela volatile, il che semplifica l'identificazione dei composti. In terzo luogo, è rapido: di norma richiede meno di cinque minuti.

Per analizzare ogni campione, scegliere il contenitore appropriato per la coltura, tenendo conto dei requisiti di crescita della specie e della consegna efficiente dei composti volatili allo spettrometro di massa. In questa dimostrazione, sono state selezionate bottiglie standard da 100 millilitri per terreno Pyre. I composti volatili batterici vengono trasportati allo spettrometro di massa mediante un flusso di gas trasportatore per l'assemblaggio del sistema di trasporto.

Le linee del gas si adattano ai flaconi di coltura con tappi filettati che presentano almeno due porti lure. Inserire le linee di ingresso e uscita del gas attraverso i porti lure e tappare eventuali porti aggiuntivi prima di coltivare i campioni. Pressurizzare i contenitori e immergerli in acqua per verificare la presenza di perdite.

Le perdite di gas sono una causa principale di risultati atipici, sotto forma di segnali ionici volatili deboli o assenti, che aumentano durante la notte. Colture di e coli, K 12 e pseudomonas aeruginosa, PAO1, in LB Lennox, preparando due repliche biologiche per ciascuna specie.

Preparare nove flaconi sterili contenenti 50 millilitri di LB Lennox e un flacone non inoculato da utilizzare come bianco; inoculare ciascuna coltura notturna in due flaconi campione. Creando repliche tecniche, incubare le colture e il bianco per 24 ore a 37 gradi Celsius. Poiché il CEMS è progettato specificamente per il campionamento di composti volatili, limitare l'uso di prodotti per la cura personale profumati prima di utilizzare lo strumento accuratamente.

Chiudere tutti i contenuti volatili in laboratorio e controllare al massimo possibile le correnti d'aria durante i test, per evitare contaminazioni dello strumento e delle linee di trasferimento del gas. Quando si utilizzano agenti biologici vitali, installare filtri con dimensione dei pori adeguata nella linea del gas di trasporto. I filtri non interferiranno con il trasferimento dei composti volatili alla camera di reazione SESI, ma potrebbero influenzare leggermente l'efficienza del trasferimento degli aerosol.

Per verificare che l'alimentazione elettrica sia spenta e che il sistema sia scarico, controllare che le spie luminose dell'alimentatore di tensione siano spente. Assicurarsi che la tensione sul multimetro sia zero e mettere a terra i cavi elettrici. A questo punto, installare la soluzione per l'elettrospruzzo da analizzare.

In modalità ioni positivi, utilizzare una soluzione di elettrospruzzo composta da acido formico 0,1%, metanolo 5% e acqua 94,9%. Per ottenere un'intensità e una stabilità del segnale ottimali, accendere il gas trasportatore di anidride carbonica e impostare la portata a due litri al minuto. Applicare pressione al serbatoio dell'elettrospruzzo per avviare il rilascio della soluzione di elettrospruzzo nella camera di reazione a una portata di cinque nanolitri al secondo. Successivamente, accendere l'alimentatore di tensione e regolare la tensione a 2,5 kilovolt.

La tensione applicata influenza l'intensità del segnale degli ioni e la stabilità del cono di elettrospruzzo per il nostro sistema con tensioni comprese tra due e cinque chilovolt. Forniscono i migliori risultati in modalità ioni positivi; prestare cautela poiché in questo punto le superfici metalliche della sorgente di ionizzazione possono provocare una scossa pericolosa. Impostare ora un metodo di taratura per monitorare lo spettro SEMS.

Deselezionare la casella di controllo per l'acquisizione multicanale o MCA. Impostare il tempo di acquisizione da 10 a 15 minuti e avviare l'acquisizione dei dati. Osservare gli spettri del fondo del gas di trasporto ed effettuare regolazioni fini della tensione applicata per ottenere un cromatogramma ionico totale stabile e scansioni riproducibili.

Continuare a raccogliere spettri e A TIC per cinque minuti per assicurare che lo strumento sia stabilizzato con lo strumento assicurato. Impostare i parametri di acquisizione in base al proprio esperimento. Registrare uno spettro di fondo del gas di trasporto per esperimenti futuri.

Per acquisire uno spettro vuoto. Indirizzare il flusso del gas trasportatore attraverso le linee di bypass, quindi collegare il campione vuoto, con le valvole chiuse, alle linee di trasferimento dello strumento. Aprire le valvole del flacone del campione e chiudere quelle delle linee di bypass.

Per spettri riproducibili. Attendere che il sistema raggiunga l'equilibrio per 30 secondi, periodo durante il quale l'umidità nella camera di reazione si stabilizza. Per assicurarsi che il sistema sia equilibrato, monitorare la TIC, che varierà durante il periodo di equilibrazione per poi stabilizzarsi.

Dopo aver raggiunto l'equilibrio del sistema, avviare la raccolta dello spettro. Al termine della raccolta dello spettro, rimuovere il flacone del campione aprendo innanzitutto le linee di bypass del gas trasportatore, quindi chiudendo le valvole del campione.

E infine, rimuovere il flacone del campione. Lavare il sistema con il gas trasportatore per due-quattro minuti per eliminare l'umidità e le sostanze volatili assorbite dalle linee di trasferimento e prevenire il trasferimento incrociato tra campioni. Raccogliere i dati dell'orma volatile per ogni campione batterico, acquisendo occasionalmente spettri bianchi aggiuntivi per garantire una completa sottrazione del bianco.

Gli spettri volatili in modalità ioni positivi per E. coli e P. aeruginosa, coltivati in aerobiosi in brodo LB Lennox per 24 ore a 37 gradi Celsius, sono distinti. Lo spettro volatile di E. coli è dominato da un picco a un rapporto massa/carica di 118, mentre lo spettro di Pseudomonas aeruginosa contiene una maggiore varietà di picchi attribuibili a proteine.

Nel corso dell'esecuzione di questa procedura, è importante registrare i parametri strumentali che sono stati ottimizzati per l'analisi, come la tensione applicata, la composizione della soluzione per l'elettrospruzzo e la portata del gas di trasporto. È inoltre fondamentale conservare i registri degli spettri rappresentativi, in modo da poter riprodurre le analisi in futuro. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni e alta tensione può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, è sempre consigliabile adottare precauzioni come limitare l'accesso al CSS CMS durante l'esperimento. A questo punto, dovreste essere in grado di ottenere in modo riproducibile uno spettro CSS ed EMS dei composti volatili batterici nel vostro sistema. Buona fortuna.