I microchip di silicio per la manipolazione di interazione cellula-cellula

Ciao, sono Elliot Hu. Sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Tia presso il Massachusetts Institute of Technology. Oggi prepareremo colture cellulari su chip micro-meccanici in silicio. I dispositivi assomigliano a piccoli pettini che si incastrano tra loro e ci permettono di manipolare con precisione le interazioni tra due diverse popolazioni cellulari.

Oggi studieremo l'interazione tra epatociti epatici e cellule stromali di supporto. In particolare, le cellule fibroblastiche 3T3 vengono coltivate sulla superficie superiore dei pettini, in modo che, spostando le dita del pettine, sia possibile muovere le cellule e modificarne la disposizione spaziale. Cadaun dispositivo è suddiviso in due parti che si agganciano insieme in due possibili configurazioni.

Il primo porta le due popolazioni cellulari a contatto reciproco. Il secondo separa leggermente le due popolazioni in modo che le cellule non possano toccarsi. In questo caso, le interazioni per contatto sono impedite, ma vengono mantenute le interazioni mediate da fattori secreti.

Iniziamo parlando di come maneggiare le parti con le pinzette. Preferisco utilizzare sia pinzette in teflon di dimensioni maggiori sia pinzette metalliche più piccole con punta arrotondata. Con le pinzette più grandi è possibile prendere le parti lungo i bordi, come questo, mentre con le parti più grandi dotate di bracci bisogna fare attenzione a non rompere i bracci poiché sono molto fragili.

Quindi si desidera prelevarli nella parte posteriore in questo modo. Con le pinzette metalliche, è possibile raggiungere all'interno del foro e prelevare direttamente i chip. Le parti più grandi si adattano in un settore di una piastra a 12 pozzetti, mentre le parti più piccole possono essere collocate in una piastra a 24 pozzetti oppure abbinate alle parti più grandi.

In una piastra a 12 pozzetti, di solito utilizzo la pinzetta metallica. Quando manipolo le parti nelle piastre per unirne due, di solito metto prima la parte più grande nel pozzetto spingendola completamente da un lato. Poi prendo la parte complementare e la posiziono sull'altro lato del pozzetto, quindi le unisco utilizzando due pinzette, inserendone una in ciascun foro.

Ora posso semplicemente bloccare le parti insieme, sia nella configurazione con spazio che in quella di contatto. Se voglio separare le parti, preferisco tirarle nella configurazione con spazio e poi sollevarle verticalmente per rimuovere il pezzo. I dispositivi sono realizzati in silicio, quindi devono essere rivestiti per consentire un'adeguata adesione cellulare.

Probabilmente riceverete i dispositivi già rivestiti con polistirene e trattati al plasma, quindi assumeremo che questo sia il nostro punto di partenza. Per prima cosa, utilizzeremo il collagene per rivestire la superficie a cui si attaccheranno gli epatociti. Porremo i pettini per epatociti in una soluzione di collagene a 50 microgrammi per millilitro e incuberemo a 37 °C per 45 minuti.

I pettini di fibroblasti, d'altra parte, non necessitano di rivestimento. Dopo l'incubazione, aspiriamo la soluzione di collagene e laviamo con acqua. Ora bloccheremo le ES a contatto con parti complementari in modo da formare una superficie piana per la semina cellulare.

Per prima cosa, riempiremo alcune pozzette con etanolo al 70%. Inserirò una coppia in ogni pozzetta e poi le bloccherò insieme. Dopo averle bloccate, dovremo osservare le parti al microscopio per assicurarci che siano complanari.

Ogni tanto le parti possono incastrarsi in modo non allineato. E sotto il microscopio si noterà che si trovano su due piani focali diversi. In questo caso, separare semplicemente le parti e riunirle nuovamente, assicurandosi che l'allineamento sia corretto. Successivamente, lasciare le parti in etanolo per un po' di tempo per sterilizzarle.

Spesso ho fretta, quindi immergo semplicemente per 10 minuti. Dopo la sterilizzazione, dobbiamo risciacquare. Aspirare completamente l'etanolo e lavare con acqua, quindi aspirare e lavare nuovamente con acqua; infine, aspirare l'acqua e sostituirla con il mezzo di coltura.

Ora seminiamo le cellule sui dispositivi. Tipicamente, sospendiamo le cellule a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro e pipettiamo un millilitro di sospensione su ciascuna coppia di pettini utilizzando una piastra a 12 pozzetti. Abbiamo quindi seminato i fibroblasti a 500.000 cellule per millilitro in due dei pozzetti.

In modo analogo, abbiamo prelevato una sospensione di 500.000 epatociti per pozzetto e li abbiamo seminati negli altri due pozzetti. Ora, prima dell'incubazione, agiteremo accuratamente le cellule per assicurarci che siano distribuite in modo uniforme. Personalmente, preferisco agitare tre volte in senso verticale, tre volte in senso orizzontale e quindi ripetere questa procedura per altre tre volte.

Dopo aver agitato, posizioneremo il campione nell'incubatore e lasceremo riposare le cellule per 15 minuti, dopodiché le agiteremo nuovamente. Dopo aver agitato ogni 15 minuti per un'ora, aspireremo la sospensione cellulare e la trasferiremo in una nuova sospensione di cellule. Ripeteremo questo procedimento fino a ottenere uno strato confluenziale di cellule.

Di solito con i fibroblasti sono necessari uno o due passaggi. Con gli epatociti possono essere necessari da due a quattro passaggi. Per ottenere un monolayer confluito, le cellule vengono seminate a una densità piuttosto elevata; l'agitazione garantisce una distribuzione uniforme delle cellule.

Dopo il primo semina, si forma uno strato di cellule rado. Si noti che le cellule si attaccano solo ai dentelli rivestiti con polistirene e collagene. Dopo la semina di cellule fresche e un'ulteriore incubazione di un'ora, sempre con agitazione ogni 15 minuti, lo strato cellulare diventa più denso.

Dopo il terzo semina, abbiamo una buona densità cellulare e ora possiamo interrompere dopo che le cellule sono state seminate sui pettini. Vogliamo manipolare le cellule per ottenere la configurazione sperimentale desiderata. I dispositivi vengono ora separati dalle loro parti complementari e incubati per 24 ore.

Dopo 24 ore, le cellule si sono espanse formando un monolayer confluito sulla superficie dei pettini. Ora vogliamo creare una co-coltura. Il pettine di epatociti e il pettine di fibroblasti vengono trasferiti nella stessa pozzetta e bloccati insieme nella configurazione iniziale desiderata.

Se desiderato. Dopo un certo periodo di tempo, è possibile modificare la configurazione. Ad esempio, possiamo passare alla configurazione con spazio vuoto dopo 18 ore; le parti vengono posizionate nello stesso punto, spinte insieme finché non si raggiunge la configurazione con spazio vuoto e poi nuovamente spinte a contatto, tornando alla configurazione con spazio vuoto.

E ora rimuoveremo un rullo. Quello che faremo adesso è sottoporre il rullo al processo di rimozione del vecchio strato di polistirene, pulire i chip e quindi applicare un nuovo strato di polistirene, preparandoli successivamente per la coltura cellulare. Ancora una volta, rimuovendo il vecchio strato di polistirene e applicandone uno fresco, ci assicuriamo che la storia del precedente esperimento non interferisca con un nuovo esperimento.

Quindi, al termine del tuo esperimento, la prima cosa che devi fare è trattare le tue cellule con candeggina e poi risciacquare i pettini e l'acqua. Pertanto, prima di inserire i chip nel toing, devi assicurarti che siano completamente asciutti. Qui abbiamo alcuni pettini che ho appena lasciato asciugare all'aria per un po’ e che sto controllando siano del tutto asciutti.

E ora prenderemo un po' di toing e lo inseriremo in questo altoparlante di vetro. Useremo una pipetta di vetro qui, in modo da non farlo sciogliere. Halloween dissolve la plastica, quindi non possiamo utilizzare una pipetta tipica in polistirene.

Bene, è sufficiente. Ora prenderemo alcune di queste parti, le posizioneremo nel recipiente e accenderò l'agitatore per agitare il contenuto; copriremo il tutto con della pellicola di alluminio per impedire che il toluene evapori. Dopo due ore, il toluene avrà disciolto la maggior parte del polistirene dai pettini, e potremo semplicemente estrarli ed essiccare i pettini all'aria.

Dopo il risciacquo di Halloween, le parti dovrebbero essere relativamente prive di polistirene e relativamente pulite. Tuttavia, è necessario che le parti siano estremamente pulite affinché il nuovo strato di polistirene formi un'adeguata adesione; se non sono estremamente pulite, il polistirene tende a staccarsi a metà dell'esperimento, quando le cellule iniziano a tirare su di esso.

Quello che faremo ora è una pulizia con acido piranha. Ho inserito i componenti in un becher di vetro e procederemo a riscaldare il tutto. Pertanto, posizioneremo il becher su un piastra riscaldante.

E qui abbiamo acido solforico e perossido di idrogeno. Verserò prima l'acido solforico e, in questo modo, assicuriamoci che tutti i chip siano immersi sotto il liquido. A volte tendono a galleggiare.

E ora che stiamo lavorando con sostanze chimiche piuttosto corrosive, assicurati di indossare l'equipaggiamento protettivo adeguato. Qui indosso guanti in nitrile. Ora verseremo il perossido di idrogeno nell'acido, quindi stai attento perché si tratta di una reazione esotermica.

Quindi si può notare che fuma leggermente durante la reazione, ma vogliamo aggiungere energia al sistema per renderlo ancora più reattivo. Ora lo riscaldiamo fino a 120 gradi Celsius, circa 120 attualmente, quindi potete essere certi che eventuali residui della coltura cellulare verranno completamente rimossi dai vostri chip. A questo punto, occorre lasciare procedere la reazione fino al termine, finché tutto il perossido di idrogeno non sarà stato consumato.

A quel punto, la miscela smetterà di effervescente. La reazione impiega circa mezz'ora per completarsi. Una volta che non si vedono più bolle, è possibile spegnere semplicemente la piastra riscaldante e lasciare raffreddare.

E ora li trasferiremo in acqua deionizzata bollente. Ancora una volta, assicurarsi di utilizzare pinzette in teflon, non metalliche, e di prelevarle semplicemente per il trasferimento. A questo punto procederemo a risciacquarle sotto un flusso costante di H₂O dd. Di solito la prelevo direttamente dal serbatoio e lascerò scorrere l'acqua per almeno 10 minuti.

E facendo ciò, elimineremo tutte le tracce di acido dopo il tritamento, sciacquando sotto un getto d'acqua per 10 minuti. L'acido dovrà essere completamente rimosso dalle scaglie, che manterremo semplicemente immerse in acqua fino al momento in cui saremo pronti per ricoprire il polistirene, ovvero polistirene con peso molecolare di 45.000 ottenuto da Sigma. Peseremo quindi una piccola quantità qui.

Abbiamo 400 milligrammi che scioglieremo in toluene a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro. Pertanto, il toluene deve essere manipolato nella cappa. Un altro aspetto importante è che, poiché utilizzeremo il toluene per sciogliere il polistirene, dobbiamo accertarci di non indossare alcun indumento da laboratorio costituito da polistirene.

Qui stiamo utilizzando polipropilene, un contenitore conico e una pipetta di vetro. Poiché ho 400 milligrammi di polistirene, aggiungerò quattro millilitri di toluene. Ora agiteremo il campione al vortex per mezz'ora, fino a quando il polistirene si sarà completamente disciolto. A questo punto, agiteremo semplicemente il tubo al vortex alla velocità più bassa per circa 20 minuti fino a mezz'ora.

Quindi, attaccherò il tubo ai vortici. Non devo tenerlo fermo per tutto il tempo. Dopo 20-30 minuti, il polistirene dovrebbe essere disciolto e saremo pronti per rivestirlo.

Ora procederemo a stendere il polistirene mediante spin coating nella nostra struttura. Il nostro spin coater si trova in un ambiente a camera pulita. Pertanto, qui dobbiamo indossare cappellino, occhiali protettivi, camice, copriscarpe e guanti, ma potrebbe non essere lo stesso nella vostra struttura.

Prima di utilizzare questo mandrino, voglio proteggerlo dal polistirene. Quindi lo ricopriremo con della pellicola di alluminio, cercando di renderla il più possibile aderente alla superficie, in modo che il chip possa appoggiarsi perfettamente. Praticheremo un piccolo foro esattamente al centro, così da poter mantenere il chip sotto vuoto.

Il programmatore di centrifuga è impostato a 2.400 giri/min e 30 secondi. Ora possiamo prendere uno dei nostri chip, posizionarlo in modo che il centro del chip copra il foro, e all'inizio, quando applico il polistirene, terrò il vuoto spento; poi accenderò il vuoto e avvierò la centrifugazione. Per le parti più piccole, possiamo applicare appena meno di 10 gocce.

Per le parti più grandi, sono necessarie un po' più di 10 gocce di polistirene. Procederemo quindi a farle centrifugare per 30 secondi a 2.400 giri al minuto. Ora prenderemo i chip rivestiti con polistirene e li metteremo in forno a 120 gradi C, una temperatura superiore al punto di transizione vetrosa del polistirene.

Pertanto, riplasmerà la superficie per renderla leggermente più liscia e, allo stesso tempo, aumenterà la densità e la durezza della plastica. Di solito lascio il pezzo in forno per tutta la notte. Probabilmente sono necessarie almeno alcune ore affinché il processo si completi.

Dopo una cottura notturna, le chip sono pronte per il trattamento al plasma. Ora esporremo il polistirene a un plasma di ossigeno, il che modificherà l'energia superficiale in modo che proteine e cellule aderiscano meglio. Caricheremo quindi le chip nella camera del plasma e porteremo l'ambiente sotto vuoto.

Un'impostazione adeguata prevede 200 mil di pressione, un giro di vuoto e una potenza di 200 watt per un minuto sotto un flusso di ossigeno gassoso. Ora che il sistema è stato portato a vuoto, introdurremo l'ossigeno. Bene, ora possiamo accendere l'alimentazione a radiofrequenza e generare il plasma per un minuto.

Quando il plasma è in funzione, in realtà emette una luminescenza. È simile a una lampadina fluorescente. Dopo un minuto di esposizione al plasma, ripristineremo la pressione a livello atmosferico e potremo estrarre i componenti.

Ora le parti sono pronte per il rivestimento proteico e la coltura cellulare. L'obiettivo nella progettazione di questo dispositivo era quello di poter manipolare l'architettura microscopica del tessuto in modo dinamico. L'organizzazione microscopica del tessuto nel corpo, in particolare la posizione delle cellule le une rispetto alle altre, è infatti molto importante per determinare la funzione di ciascuna cellula specifica in coltura di laboratorio.

Fino a poco tempo fa, non siamo stati in grado di replicare efficacemente questo processo, ma negli ultimi cinque o dieci anni le persone hanno iniziato a poter micro-patterningare le cellule su un substrato per colture cellulari, posizionando così le cellule esattamente dove desideriamo che si trovino in una piastra per colture cellulari. In questo modo, sono riusciti a scoprire alcuni aspetti importanti della biologia fondamentale delle interazioni tra cellule a livello microscopico. Tuttavia, ciò che non siamo stati in grado di fare fino a questo momento è realizzare questo processo in modo dinamico.

Questo significa modificare l'organizzazione di una coltura cellulare nel bel mezzo del tuo, dell'esperimento. E questo è importante perché nel corpo, quindi nei tessuti, l'ambiente non è effettivamente statico. Abbiamo cellule che si muovono e si riorganizzano, in particolare durante la guarigione delle ferite o lo sviluppo.

Ma anche in un organo normale in omeostasi, c'è molto movimento. L'aspetto tecnico più difficile da imparare è come manipolare fisicamente le parti. Inizialmente, quando si inizia a lavorare con il sistema, si può essere intimiditi dalla fragilità delle parti o dalla piccolezza dei movimenti che è necessario eseguire.

Ma penso che se si pratica per un breve periodo, non si dovrebbero avere troppi problemi. Alcuni dei contesti in cui osserviamo che questo dispositivo svolge un ruolo, ad esempio nello sviluppo embrionale, sono quelli in cui le cellule entrano in contatto con una serie di diversi ambienti cellulari man mano che si espandono attraverso vari strati embrionali. È noto che le interazioni con ciascuno strato, man mano che avvengono in successione, spingono le cellule lungo un percorso specifico di differenziamento.

Pensiamo quindi che questo tipo di dispositivo possa essere utile per cercare di riprodurre questo tipo di evento in laboratorio. Uno degli aspetti dell'organizzazione microscopica che volevamo esaminare in particolare era la differenza tra cellule che comunicano attraverso interazioni di contatto, in cui le membrane cellulari possono toccarsi direttamente, e fattori solubili che vengono secreti nel mezzo circostante e diffondono verso una cellula posta a una certa distanza. Spesso, quando le cellule sono in co-coltura e influenzano reciprocamente la loro attività, non è chiaro se tale effetto sia dovuto a interazioni di contatto o a fattori secreti a svolgere un ruolo determinante.