Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare
6 maggio 2011
Morte cellulare programmata test comunemente usati nei sistemi di mammiferi, come laddering DNA o saggi TUNEL, sono spesso difficili da riprodurre nelle piante. In combinazione con un sistema di giornalista GUS, proponiamo un rapido test basato impianti transitori per analizzare le proprietà morte potenziale di specifici geni.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un sistema reporter Gus per analizzare le potenziali proprietà pro-apoptotiche di geni specifici. I geni di interesse vengono clonati in una cassetta Gus e fatti crescere nei vettori di agrobatterio appropriati sotto un promotore 35S. Questi vettori vengono quindi trasformati nella ceppa di Agrobacterium LBA 4404 e mescolati con una coltura contenente una cassetta di espressione Gus per infiltrare le foglie di Nicotiana benthamiana.
L'attività di Gus può essere valutata visivamente mediante colorazione istochimica oppure in modo quantitativo tramite saggio fluorimetrico con mug. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il DNA laddering o il saggio TUNEL comunemente utilizzati nei sistemi mammiferi ma difficili da riprodurre nelle piante, è che si tratta di un saggio transiente basato sulle piante, sensibile e rapido, che sfrutta il semplice fatto che sono necessarie cellule vive affinché avvenga l'espressione di Gus. A dimostrare la procedura oggi sarà Hua RAOs.
Un ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio. L'infiltrazione richiede foglie sane completamente sviluppate di piante di nicotiana benthamiana di età compresa tra tre e sei settimane, coltivate a 25 gradi Celsius. È necessario pianificare l'esecuzione di questo protocollo nell'arco di otto giorni. Nel primo giorno, effettuare lo streaking su piastra utilizzando stock glicerolati di agrobacterium tumefaciens contenenti i vettori per il saggio di morte cellulare e il vettore con la cassetta di espressione Gus; includere sempre anche un vettore vuoto come controllo negativo o "stuffer", quando vengono testate più combinazioni di colture.
Incubare le piastre a 28 gradi Celsius per due giorni. Il terzo giorno, inoculare due millilitri di LB selettivo con una singola colonia proveniente da ciascuna piastra. Incubare ogni coltura sotto agitazione a 28 gradi Celsius per 24 ore a 200 giri al minuto, fino al raggiungimento della massima densità di crescita.
Dopo 24 ore di incubazione, risospendere completamente la coltura mediante pipettaggio se è presente aggregazione, e aumentare il volume totale di ciascuna coltura a 10 millilitri con LB selettivo fresco per indurre i geni di virulenza dell'agrobatterio. Aggiungere acetone fino a una concentrazione di 25 micromolari e incubare ciascuna coltura sotto agitazione a 28 gradi Celsius per altre 16 ore. Il passaggio successivo consiste nel centrifugare ciascuna coltura a 4.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di infiltrazione.
Non aggiungere acetone, centrifugare nuovamente le colture, ma ora sospendere ogni pellet in cinque millilitri di mezzo di infiltrazione contenente 100 micromolar di acetone. Misurare ora l'OD a 600 nanometri.
Concentrazioni pari a 0,1 sono accettabili, ma se superiori a 0,9, diluire fino a 0,9 con mezzo di infiltrazione e acetone prima dell'infiltrazione. Incubare nuovamente le colture a 28 gradi Celsius con agitazione per tre ore dopo l'incubazione. Mescolare le colture sperimentali e le colture di controllo in rapporto uno a uno con la coltura contenente la cassetta Gus.
Per ogni coltura, utilizzare una siringa da un millilitro senza ago per infiltrare il sigillo ABA o la pagina inferiore delle foglie appena emergenti. Il volume di infiltrazione non è importante. Quando si forma un'area di impregnazione acquosa, significa che è stata aggiunta una quantità sufficiente; infiltrare sia il controllo negativo che il gene da sottoporre a saggio su foglie opposte della stessa pianta, quindi infiltrare altre due piante nello stesso modo.
Pertanto, ci sono tre piante per ogni coltura. Tre giorni dopo l'infiltrazione, è il momento di raccogliere le foglie e analizzare l'espressione della proteina gust. Iniziare l'analisi istochimica infiltrando a vuoto l'intera foglia con il substrato XLU fino a quando non sarà completamente impregnata.
Ora, incubare le foglie al buio a temperatura ambiente durante la notte o fino a quando appare una colorazione blu distinta; quando la colorazione blu è evidente, risciacquare le foglie con acqua distillata e incubarle in etanolo al 70% durante la notte, fino a quando la clorofilla viene rimossa. Il giorno successivo, risciacquare le foglie con acqua distillata e valutare i livelli di espressione di GUS.
Per quantificare l'espressione di Gus, un substrato mug viene convertito in un prodotto fluorescente mu, misurabile iniziando con la macerazione di dischetti fogliari infiltrati in un mortaio utilizzando azoto liquido. Aggiungere quindi 100 microlitri di buffer di estrazione GUS mantenendo il campione sul ghiaccio. Centrifugare ora la sospensione a 14.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il soprannatante contenente le proteine solubili totali, tra cui Gus.
Misurare la concentrazione totale di proteine solubili utilizzando un NanoDrop e regolare la concentrazione a 100 microgrammi di proteina totale per ogni campione nel buffer di estrazione Gus. Aggiungere ora il substrato mug nel buffer di estrazione Gus a ciascun campione fino a una concentrazione finale di due millimoli di mug. Un volume totale di 100 microlitri per campione dovrebbe essere sufficiente; mescolare mediante pipettaggio e incubare la reazione per un'ora a 37 gradi Celsius.
Dopo un'ora, interrompere la reazione aggiungendo 800 microlitri di buffer stop gusts. Per quantificare la mu, 100 microlitri di ogni campione vengono caricati su una piastra microtitolata, che viene analizzata in un lettore di piastre; la fluorescenza viene misurata a 365 nanometri di lunghezza d'onda di eccitazione e 455 nanometri di emissione, e confrontata con una curva standard. L'attività Guss può quindi essere espressa come M di mu per microgrammo di proteina solubile totale al minuto di reazione. Vengono rilevati diversi livelli di gust a seconda del costrutto utilizzato, quando la cassetta di espressione GUS viene co-infiltrata con un regolatore negativo della morte cellulare o con un gene anti-morte.
Livelli elevati di Gus sono osservati in confronto. I livelli di Gus nel controllo con vettore vuoto sono molto più bassi. Al contrario, quando viene utilizzato un regolatore positivo della morte cellulare o un gene pro-morte, si osserva una marcata riduzione dell'espressione di Gus rispetto al controllo con vettore vuoto.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questa tecnica viene utilizzata come passo iniziale per determinare il potenziale di geni specifici. Sono necessari ulteriori lavori per confermare questi risultati iniziali e per determinare il tipo di cellula coinvolto.
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Panoramica
Questo studio presenta un saggio transitorio rapido basato su piante, che utilizza un sistema reporter GUS per analizzare le potenziali proprietà letali di geni specifici. Il metodo affronta le difficoltà di riprodurre saggi di morte cellulare programmata di origine mammifera in sistemi vegetali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Saggi di morte cellulare
- Ingegneria genetica
Sfondo
- La valutazione della morte cellulare programmata è fondamentale per comprendere i processi cellulari.
- Le tecniche tradizionali come il DNA laddering e il saggio TUNEL sono difficili da applicare nelle piante.
- I sistemi con reporter GUS forniscono un metodo visivo e quantitativo per valutare l'attività genica.
- La trasformazione mediata da Agrobacterium è una tecnica comunemente utilizzata negli studi genetici delle piante.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile e rapido per analizzare la morte cellulare indotta da geni nelle piante.
- Utilizzare un sistema di reporter GUS per una valutazione visiva e quantitativa.
- Migliorare la riproducibilità dei saggi di morte cellulare nei sistemi vegetali.
Metodi Utilizzati
- Clonaggio dei geni di interesse in una cassetta GUS.
- Trasformazione di Agrobacterium con la cassetta espressiva GUS.
- Infiltrazione delle foglie di Nicotiana benthamiana con Agrobacterium trasformato.
- Valutazione dell'attività GUS mediante colorazione istochimica e saggi fluorometrici.
Risultati principali
- Il sistema reporter GUS ha indicato efficacemente l'attività genica nelle cellule vegetali.
- La colorazione istochimica ha fornito una rappresentazione visiva dell'attività GUS.
- La prova fluorometrica ha permesso una misurazione quantitativa dell'espressione genica.
- Il metodo ha dimostrato una sensibilità maggiore rispetto ai saggi mammiferi tradizionali.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato rappresenta uno strumento prezioso per lo studio della morte cellulare indotta da geni nelle piante.
- Questo metodo migliora la capacità di analizzare funzioni geniche specifiche delle piante.
- Applicazioni future potrebbero includere studi più ampi sulle interazioni geniche nella biologia vegetale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio reporter di GUS di origine vegetale fornisce un metodo rapido e sensibile per lo screening iniziale della funzione genica nei percorsi di morte cellulare, colmando una lacuna fondamentale nella traduzione dei meccanismi di apoptosi dei mammiferi ai sistemi vegetali. Permettendo un'analisi funzionale in fase precoce di regolatori pro- e anti-morte, il saggio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella biologia della scoperta. I suoi risultati quantitativi e visivi facilitano il test delle ipotesi e la priorizzazione di bersagli genetici prima di destinare risorse a modelli preclinici successivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando l'espressione genica a fenotipi di morte cellulare in un sistema dipendente da cellule vive.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di espressione transitorio e rapido per lo screening funzionale di geni candidati senza richiedere la trasformazione stabile.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante letture quantitative dell'attività GUS che si correlano con funzioni pro- o anti-apoptotiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative fluorometriche dell'attività GUS che permettono analisi dose-risposta e confronti tra costrutti genici.
- Valore operativo: Utilizza un protocollo standardizzato di infiltrazione mediata da Agrobacterium, compatibile con flussi di lavoro per schermature ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Produce risultati costanti e riproducibili, adatti allo screening di librerie di composti o genetiche in sistemi a base vegetale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega l'analisi della funzione genica nella fase di scoperta alla validazione preclinica identificando regolatori conservati della morte cellulare attraverso diversi regni.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi di troncamenti proteici per dedurre gli effetti delle modifiche post-traduzionali, fornendo informazioni sulle relazioni struttura-funzione.
- Conferma predittiva: Consente una valutazione precoce della funzione genica in un sistema rilevante per la malattia, riducendo l'ambiguità nella selezione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio e l'identificazione di composti promettenti mediante letture funzionali che informano decisioni di avanzamento o interruzione prima di investire in modelli mammiferi o modelli preclinici complessi.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'associazione tra coespressione genica e variazioni misurabili dell'attività GUS come indicatore della modulazione della morte cellulare.
- Screening: Permette la standardizzazione del saggio attraverso la co-infiltrazione controllata di costrutti del gene d'interesse e del reporter GUS, supportando output quantitativi riproducibili.
- Analisi: Fornisce una quantificazione fluorimetrica dell'attività GUS (unità di fluorescenza per µg di proteina totale al minuto), consentendo un confronto oggettivo tra diverse condizioni genetiche.
- Ricerca traslazionale: Favorisce l'estrapolazione tra regni analizzando sia regolatori della morte cellulare vegetali (famiglia BAG) che mammiferi (BAX) in un formato di saggio comune.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di modificatori genetici della morte cellulare, adattabile a diverse classi di bersagli e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi positivi mediante letture di reporter dipendenti da cellule vive.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie a protocolli definiti per infiltrazione, incubazione e quantificazione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rapido triage dei bersagli genici prima di impegnare risorse in validazioni dispendiose.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo dati funzionali precoci su candidati genici coinvolti nei percorsi di morte cellulare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'espressione transitoria mediata da Agrobacterium e nella manipolazione dei tessuti vegetali.
- Presuppone l'accesso a lettori fluorometrici a piastre e a infrastrutture per la colorazione istochimica per il rilevamento di GUS.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di induzione con acetone e della misura dell'OD600 attraverso le colture, al fine di ottenere un'attivazione riproducibile dei geni di virulenza.
- Richiede considerazioni adattative qualora si intenda estendere il metodo a sistemi vegetali diversi da Nicotiana benthamiana o a geni reporter alternativi.
- Limitato alla schermatura funzionale iniziale; richiede una validazione ortogonale in sistemi mammiferi o rilevanti per la malattia per garantire affidabilità traslazionale.
