ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l'influenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare un nuovo e rapido metodo di amplificazione del segnale per rilevare e caratterizzare sottotipi virali dell'influenza sul chip per l'influenza, una piattaforma di microarray a bassa densità. Questo viene ottenuto incorporando DTP biotinilati e utilizzando primer con un'estremità fosfato in posizione 5' per amplificare il segmento del gene della matrice e un segmento del gene non strutturale da estratti di RNA influenzale. Successivamente alla PCR, si effettua una digestione enzimatica e una frammentazione per generare un prodotto virale amplificato, monocatenario e biotinilato, che viene quindi ibridato all'array dopo l'ibridizzazione.

Il rilevamento Fox utilizza la fotopolimerizzazione per far crescere ampie macchie polimeriche nei punti in cui avviene l'ibridazione, e i modelli differenziali di ibridazione vengono impiegati per rilevare i sottotipi virali dell'influenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento fluorescente standard, è che è piuttosto economico e fornisce un risultato rapido visibile ad occhio nudo, con una sensibilità analitica simile a quella della fluorescenza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla caratterizzazione dei virus influenzali mediante l'utilizzo del chip per l'influenza, in quanto si tratta di un metodo di rilevamento universale.

Ampl Fox può essere applicato anche a una vasta gamma di altri sistemi, come microarray a bassa densità basati su DNA e proteine. In teoria, qualsiasi prodotto biotinilato dovrebbe poter essere rilevato utilizzando amox. A dimostrare il procedimento saranno Amber Taylor, scienziata associata, e Kevin Moulton, assistente di ricerca presso Endeavor, che sono stati entrambi fondamentali nello sviluppo dello strumento Fox e della chimica di rilevamento negli ultimi anni.

Estrarre l'RNA virale da 200 microlitri di isolato virale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA virale e seguendo il protocollo del produttore. Eluire in un volume finale di 60 microlitri e conservare gli estratti a meno 70 gradi Celsius o a temperature inferiori per un uso successivo. Successivamente, preparare la miscela master di RT-PCR in ghiaccio seguendo il protocollo del produttore.

Utilizzando una miscela di DNTP BIOTINILATI, aggiungere la miscela di primer per il chip del virus dell'influenza, che contiene le concentrazioni indicate, al mix master. Un primer di ogni set deve contenere un gruppo fosfato in posizione 5' per facilitare la digestione enzimatica. Il set di primer per l'influenza A produce un prodotto di 1032 paia di basi, mentre il set di primer per l'influenza B produce un prodotto di 811 paia di basi.

Vortexare brevemente e distribuire 18 microlitri di mix master in provette PCR con pareti sottili. Aggiungere quindi due microlitri di stampo RNA in ciascuna provetta di reazione. Trasferire le provette PCR in un termociclatore e utilizzare un profilo di amplificazione con una temperatura di annealing appropriata.

Il profilo di ciclaggio utilizzato in questo saggio è mostrato qui. Preparare la miscela di digestione enzimatica combinando 2,2 microlitri di tampone per la reazione enzimatica, 0,8 microlitri di acqua priva di nucleasi e 1,0 microlitro di enzima lambda esonucleasi per ogni reazione PCR. Rimuovere i campioni dal termociclatore e aggiungere quattro microlitri a ciascuna provetta PCR.

Riportare i campioni nel termociclatore e impostare il termociclatore a 37 gradi Celsius per 15 minuti, seguiti da 95 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, applicare pozzi di ibridazione monouso intorno ai microarray da ibridare. Quindi lavare le lamelle in 110 millilitri di acqua purificata su un agitatore orbitale per cinque minuti.

Asciugare le vetrine toccando delicatamente con un fazzoletto di carta il bordo del pozzetto. Combinare 22 microlitri di buffer di ibridazione 2x con ciascun prodotto di DNA a singolo filamento frammentato, mescolare brevemente e pipettare 40 microlitri nei pozzetti dell'array. Lasciare avvenire l'ibridazione delle vetrine per un'ora in una camera umidificata; al termine dell'ibridazione, rimuovere le vetrine dalla camera umidificata e risciacquare brevemente ciascuna vetrina con due millilitri di buffer di lavaggio D. Posizionare le vetrine in un portavetrini.

Successivamente, aggiungere 110 millilitri dei tamponi di lavaggio A e B in contenitori separati utilizzando un agitatore orbitale. Lavare la cassetta per vetri nel tampone A a 60-90 giri al minuto, la velocità utilizzata per tutti i successivi lavaggi, per un minuto. Rimuovere quindi la cassetta per vetri dal tampone di lavaggio A e risciacquare brevemente con il tampone di lavaggio D. Trasferire la cassetta per vetri nel tampone di lavaggio B e lavare sull’agitatore orbitale per cinque minuti.

Dopo il lavaggio, asciugare delicatamente gli array su ogni vetrino con un fazzoletto di carta e posizionare i vetrini asciutti nella camera di umidità. In preparazione ai passaggi di rilevamento colorimetrico per fox, combinare 10 microlitri di ampiezza, 20 microlitri di buffer due x ampiezza e 10 microlitri di acqua purificata per ogni array da processare, trasferire 40 microlitri della miscela di marcatura su ogni array e lasciare procedere la reazione di marcatura in una camera di umidità chiusa per cinque minuti. Durante l'ibridazione, preparare 110 millilitri di buffer di lavaggio C in un contenitore. Dopo la marcatura, risciacquare immediatamente ogni array con il buffer di lavaggio D. Posizionare ogni vetrino nel porta vetrini e lavare nel buffer C su agitatore orbitale per cinque minuti; dopo il lavaggio con il buffer C, immergere brevemente il porta vetrini tre volte in un contenitore contenente acqua purificata.

Per rimuovere i residui di sale, asciugare le matrici come mostrato in precedenza. Conservare le matrici in una scatola per diapositive al buio fino all'attivazione fotochimica e all'acquisizione delle immagini, che devono essere completate entro 24 ore. Successivamente, accendere il lettore Amli Fox e assicurarsi che il software Amli View sia pronto per l'attivazione fotochimica prima del rilevamento del campione sulla matrice.

Per prima cosa, determinare il tempo ottimale di attivazione fotochimica per tutti i campioni seguendo una breve procedura di calibrazione. Una volta al giorno, riscaldare la soluzione Amplify a temperatura ambiente e vortexare brevemente; pipettare tre microlitri di amplificatore nel flacone Amplify e vortexare accuratamente. Applicare uniformemente per 10 secondi 40 microlitri di soluzione Amplify su un solo vetrino alla volta, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.

Inserire il vetrino microarray nella baia di attivazione fotodinamica dell'Amplify Reader. Avviare l'attivazione fotodinamica selezionando "start" nel software della vista PL, utilizzando il tempo di attivazione fotodinamica determinato nel processo di calibrazione. Al termine, risciacquare il microarray con due millilitri di acqua purificata per rimuovere l'eccesso di polimero Amplify Clear. A questo punto, la formazione del polimero è avvenuta nelle aree contenenti il DNA bersaglio, ma risulta meglio visualizzabile.

Dopo la colorazione, lasciare asciugare le macchie polimeriche per due minuti. Quindi distribuire due gocce di amply red sull'array e lasciare procedere la colorazione per due minuti. Dopo la colorazione, risciacquare rapidamente il vetrino con acqua purificata ed essiccare come mostrato in precedenza; inserire quindi il vetrino nel vano di acquisizione del lettore Amli Fox per acquisire un'immagine utilizzando il software amli per l'elaborazione dei risultati. L'immagine a sinistra mostra il rilevamento di un campione del nuovo H1N1 del 2009 mediante Amli Fox.

Mentre l'immagine a destra utilizza la fluorescenza tradizionale generata da uno scanner microarray a fluorescenza confocale, lo stesso schema complessivo di rilevamento è facilmente osservabile con entrambi i metodi. Tuttavia, il risultato di Amli fox è visibile ad occhio nudo. Queste immagini mostrano i risultati del test flu chip provenienti da ceppo umano, H tre N due di origine umana, H uno N uno, di origine suina, H uno N uno, e un array fox negativo privo di influenza rilevabile.

Le sequenze due e tre delimitate in blu producono un segnale per tutti i sottotipi di influenza A mostrati, ma le sequenze delimitate in rosso in basso a destra producono un segnale solo per il campione di origine suina H1N1. Il campione negativo mostra un segnale su una sequenza di controllo interno delimitata in verde, indicando l'assenza di inibizione o di fallimento della reazione RT-PCR.

Dopo aver acquisito padronanza, l'intero processo, dall'estrazione delle provette fino al rilevamento dell'amoxicillina e all'interpretazione del risultato finale, può essere eseguito in circa sei ore. La parte di rilevamento Ampl Fox della procedura, inclusa la calibrazione dello strumento, può essere completata in circa 30 minuti seguendo questo protocollo. Altri metodi, come il sequenziamento parziale o completo del genoma, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande.

Questo saggio per l'influenza è concepito come un'analisi iniziale, in particolare per campioni che producono un profilo di ibridazione unico. Poiché il rilevamento è un saggio generale, speriamo che i ricercatori individuino nuove e interessanti applicazioni di microarray a bassa densità alle quali il rilevamento possa aggiungere valore.