Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Il mantenimento dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate e morenti senza compromettere la funzione di barriera. Per raggiungere questo obiettivo, l'epitelio espelle le cellule morenti formando e contraendo un anello di actina e miosina nella cellula circostante la cellula morente, espellendola e chiudendo contemporaneamente eventuali lacune risultanti dalla sua uscita. In questo articolo video, viene descritto un metodo per indurre e visualizzare in tempo reale l'espulsione di cellule apoptotiche dall'epidermide di pesci zebra larvali.

Ciò viene mostrato mediante l'iniezione di una sonda per l'actina F marcata con una proteina fluorescente rossa in embrioni di pesce zebra transgenici allo stadio di una singola cellula che esprimono la proteina fluorescente verde nell'epidermide, al fine di visualizzare i filamenti di actina nei tessuti epiteliali. Le larve di quattro giorni dopo la personalizzazione che esprimono sia GFP che RFP vengono quindi trattate con G418 per indurre l'apoptosi nell'epidermide. La dinamica dell'actina e le variazioni della forma delle cellule epiteliali che si verificano durante l'estruzione sono visualizzate mediante acquisizione temporale su un microscopio confocale a disco rotante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le analisi di forza immunitaria è che possiamo osservare rapidi cambiamenti e la dinamica dell'actina che si verificano durante il processo di estrusione in un tessuto epiteliale vivente. In questo video, vi mostreremo un procedimento per l'acquisizione in tempo reale dell'estrusione di cellule apoptotiche dall'epidermide di pesci zebra in via di sviluppo. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per comprendere come le cellule riorganizzino in modo coordinato il loro citoscheletro di actina per rimuovere le cellule apoptotiche mantenendo al contempo la funzione di barriera, e come il disturbo del processo di estrusione possa portare a determinati stati patologici.

Cominciamo. Per visualizzare la dinamica dell'actina durante l'espulsione cellulare nell'epidermide di zebrafish in via di sviluppo, iniziare scongelando su ghiaccio l'RNA precedentemente trascritto. Trascriviamo mRNA che codifica per una proteina fluorescente rossa fusa al dominio di omologia della calpa nel utrofina e nell'actina binding protein. Aggiungere fenolo rosso all'RNA in rapporto uno a uno per ottenere una concentrazione finale di RNA di circa 30 nanogrammi per microlitro e caricare un microlitro di soluzione in un ago capillare tirato mediante riempimento retrogrado.

Raccogliere circa 75 embrioni allo stadio a una cellula C-K-G-F-P nel tampone E three. Pipettare gli embrioni raccolti nello stampo per microiniezione utilizzando una pipetta per pasta da cinque e tre quarti e orientare delicatamente gli embrioni nella scanalatura con pinzette FST Dumont numero cinque. Lavorare rapidamente per evitare di dover iniettare l'RNA in embrioni a stadi multipli sotto un microscopio stereoscopico da dissezione standard da laboratorio.

Utilizzare un microinjector controllato dalla pressione per iniettare l'RNA nel tuorlo degli embrioni come fossile del fenolo. Dopo l'iniezione, il rosso dovrebbe essere visibile nell'embrione. Assicurarsi di iniettare almeno 50 embrioni per ogni esperimento.

Separare gli embrioni per rimuovere quelli non fecondati o danneggiati e incubare tutti gli embrioni rimanenti a 28 gradi Celsius. Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per selezionare gli embrioni di pesce zebra che presentano un elevato livello di fluorescenza GFP nell'epidermide e fluorescenza dell'actina marcata con RFP. Incubare gli embrioni selezionati a 28 gradi Celsius fino al momento di procedere con il trattamento farmacologico per indurre l'esposizione all'apoptosi mediante aminoglicoside.

L'antibiotico G quattro 18 o un medicamento provoca l'estruzione di cellule apoptotiche dall'epidermide delle larve di pesce zebra in via di sviluppo. È importante sottolineare che questo trattamento funziona soltanto su larve di almeno quattro giorni post-fecondazione per indurre l'estruzione cellulare. Raccogliere fino a 25 larve di pesce zebra di quattro giorni post-fecondazione che esprimono sia GFP che RFP in una piastra di coltura di 35 per 10 millimetri contenente tre millilitri di mezzo E tre.

Sostituire con attenzione il mezzo con tre millilitri di E tre contenenti un milligrammo per millilitro di G quattro 18 e incubare le larve nel farmaco per quattro ore al buio a 28 gradi Celsius. Rimuovere quindi il mezzo e sostituirlo con mezzo E tre preriscaldato contenente lo 0,02% di trica, quindi procedere al montaggio delle larve per l'acquisizione di immagini. Trasferire fino a tre larve in una provetta da 1,5 millilitro e rimuovere la maggior parte del mezzo E tre.

Utilizzando una punta di pipetta tagliata, pipettare 120 microlitri di agarosio al 1% a basso punto di fusione nel tubo e mescolare. Quindi, pipettare delicatamente la larva e la miscela di agarosio sulla lamella di vetro situata sul fondo di una piastra per colture Matech. Utilizzando un supporto per perni FST con un perno inserito o un ago di tungsteno applicato, posizionare rapidamente le larve in modo che siano dritte e aderiscano piatte alla lamella di vetro.

Lasciare solidificare l'aose. Quindi riempire delicatamente la piastra con mezzo E tre contenente lo 0,02% di trica. Abbiamo osservato che l'intero processo di espulsione delle cellule apoptotiche dall'epidermide delle larve di pesce zebra in via di sviluppo richiede circa 20 minuti.

Qui illustriamo come impostare un esperimento di imaging a intervalli utilizzando un microscopio confocale a disco rotante e il software and or IQ per acquisire una serie temporale di piani Z attraverso un singolo strato dell'epidermide del pesce zebra. Innanzitutto, accendere i laser a argon e all'elio-neon, la telecamera del microscopio e la lampada epifluorescente all'interno del software and or IQ. Creare un protocollo per serie temporale contenente le lunghezze d'onda da acquisire.

La frequenza degli intervalli tra le acquisizioni delle immagini e il numero di volte in cui l'acquisizione deve essere ripetuta. Posizionare delicatamente la piastra Mattec contenente il campione sul palchetto del microscopio, quindi utilizzare un obiettivo 20 volte con luce trasmessa per mettere a fuoco le larve. Portare l'obiettivo ad immersione in acqua 40 volte nella posizione corretta. Con questo obiettivo, possiamo filmare circa 20-25 cellule per campo, il che ci permette di seguire i comportamenti cellulari durante l'espulsione, risolvendo al contempo la dinamica subcellulare dell'actina.

Posizionare con attenzione una goccia d'acqua sulla parte superiore dell'obiettivo 40x e posizionare rapidamente la piastra Mattec sopra. Identificare il campione utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, quindi utilizzare la fluorescenza episcopica a 488 nanometri per focalizzarsi specificamente sull'epidermide positiva per GFP. Passare alla modalità di scansione confocale.

Regolare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per ciascuno dei canali in modo appropriato. Prestare attenzione a bilanciare la potenza del laser e il tempo di esposizione per una rilevazione ottimale del segnale e per prevenire qualsiasi fototossicità. Per identificare le cellule in estrusione, utilizzare la fluorescenza episcopica per visualizzare l'epidermide marcata con GFP e identificare un gruppo di cellule disposte in un tipico modello a rosetta, costituito da un insieme di cellule che circondano una piccola cellula rotonda al centro.

Inoltre, dovrebbe verificarsi un accumulo dell'actina marcata con RFP, visibile come un anello attorno alla piccola cellula rotonda al centro, un segno distintivo dell'estruzione cellulare. Una volta identificata una cellula in fase di estrusione, impostare rapidamente i limiti superiore e inferiore per la serie Z e la dimensione del passo. Quindi iniziare ad acquisire quattro set di dati confocali in 4D per visualizzare i dati e osservare la contrazione dell'anello di actina e i comportamenti epiteliali che si verificano attorno alla cellula morente.

Nel tempo, realizzare proiezioni 3D della serie Z e salvare i dati come file video. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando diversi pacchetti software. Questa figura mostra l'espressione di RFP UTR CH nell'epidermide di larve di pesce zebra CK GFP a quattro giorni dalla fecondazione.

Qui sono mostrate immagini fisse di proiezioni Z tratte da un filmato in time-lapse che illustra la dinamica dell'actina in tempo reale. Durante il processo di espulsione delle cellule epiteliali, le frecce indicano l'anello di actina formato dalle cellule adiacenti, il quale si contrae e si chiude nell'arco di due minuti. Seguendo questa procedura, possiamo utilizzare altri metodi in combinazione con questa tecnica, come l'impiego di inibitori chimici o mutazioni genetiche, per comprendere meglio come alterazioni dell'espulsione possano portare a determinati stati patologici.

Derivando dall'incapacità di rimuovere le cellule apoptotiche, vi abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento di imaging in time-lapse per visualizzare il processo di estrusione dall'epidermide del pesce zebra in via di sviluppo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di limitare la quantità di luce a cui viene esposto il campione per prevenire fenomeni di fotobleaching o tossicità. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.