Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

Il mio nome è Jiang, sono un ricercatore post-dottorato di Harvard e del MIT, Health, Sciences and Technology. La mia competenza in laboratorio consiste nel generare nuovi dispositivi My Predict per lo studio del comportamento cellulare. Posso creare anche dispositivi per gradienti molto innovativi, nonché integrarli al dispositivo My Predict.

Il dispositivo TC può manipolare con precisione l'interazione tra cellula e cellula, l'interazione cellulare e il contatto con i fattori solari cellulari. Utilizzando il sistema TC, posso quindi studiare e comprendere la biologia cellulare di base, nonché applicare principi della biologia dello sviluppo e della bioingegneria delle cellule staminali. Mi chiamo Amir Manchi e sono uno studente universitario nel laboratorio del professor Haan presso la Divisione di Scienze della Salute e Tecnologia di Harvard e MIT.

E ho lavorato a dispositivi microfluidici e abbiamo cercato, come prova di principio, di dimostrare che i dispositivi microfluidici sono strumenti con notevole potenziale per la coltura cellulare e per svolgere diversi tipi di studi, come ad esempio studi di tossicità. Abbiamo inoltre cercato di studiare e ottimizzare la caratterizzazione del flusso all'interno di questi dispositivi in funzione della portata, della geometria e di altri parametri. Al momento stiamo partendo dalla stanza di microfabbricazione e quello che faremo sarà realizzare alcuni dispositivi microfluidici. Per far sì che questi dispositivi microfluidici siano realizzati, abbiamo bisogno di wafer di silicio con schemi specifici e di stampi in PDMS posizionati su di essi. Questo polimero in PDMS è in realtà una miscela di due componenti diversi.

È una miscela di base di elastomero siliconico e agente indurente per elastomero siliconico. Il metodo di miscelazione prevede un rapporto di 10 a 1, ovvero 10 parti di base e 1 parte di agente indurente. Ora desidero circa 20 grammi di base qui.

Ho bisogno anche di due grammi dell'agente indurente e l'agente indurente è molto meno denso. Scorrerà molto più velocemente e devo fare un po' di attenzione. Ora è circa 22 e voglio mescolare insieme la base e l'agente indurente.

Quindi userò un cannello per fare questo. Cercherò di mescolarlo nel modo più accurato possibile. Voglio versare questo polimero PDMS sulla superficie delle wafer di silicio che presentano un motivo sulla loro superficie; la wafer di silicio aiuta a conferire il motivo agli stampi in PDMS.

Si può notare che ho due wafer di silicio proprio qui e il motivo è che uno di essi è destinato allo strato superiore del nostro dispositivo microfluidico e l'altro allo strato inferiore. Abbiamo bisogno di due strati nei dispositivi microfluidici perché vogliamo realizzare un canale al loro interno e l'idea fondamentale alla base dei dispositivi microfluidici è quella di ottenere un flusso all'interno di tali canali. Per questo motivo, devo versare questa miscela su entrambi i wafer di silicio, poiché nella miscela sono presenti molte bolle d'aria.

Voglio eliminare queste bolle e, a tale scopo, utilizziamo il vuoto per rimuoverle. Siamo tornati nell'area principale del laboratorio e, come vi ho detto in precedenza, all'interno della miscela di PDMS sono presenti numerose bolle che dobbiamo eliminare. Posizionerò le miscele sopra le piastrine di silicio all'interno della camera a vuoto. Chiuderò la camera e attiverò il vuoto. Al termine di questa fase, lasceremo gli stampi di PDMS all'interno di un forno per tutta la notte, in modo da renderli più solidi.

Bene, siamo ora in laboratorio e vogliamo assemblare questi dispositivi microfolici. Prenderemo innanzitutto i modelli in PDMS, che sono stati all'interno dell'incubatrice per tutta la notte e nei quali si sono formate le strutture corrispondenti a quelle presenti sulle wafer di silicio. Utilizzerò due modelli diversi. Sul lato sinistro potete vedere il microcanale, che costituirà lo strato superiore, mentre sul lato destro sono visibili delle linee verdi che formeranno lo strato inferiore.

E questo formerà le scanalature all'interno del microdispositivo. Inizio tagliando questi gel per poter ottenere lo strato superiore, in modo che si separi facilmente dalla piastrina di silicio. Quello che farò è trasferirlo in questa piastra di Petri con la faccia verso l'alto, in modo che i motivi siano rivolti verso l'alto.

E proverò la stessa cosa per le scanalature, che erano i modelli a linee verdi. Queste formeranno lo strato inferiore. Una volta tagliato il gel, lo trasferirò nella piastra di Petri e, per evitare che si depositi polvere sopra i modelli, li coprirò con del nastro adesivo.

Il passo successivo consiste nel forare le estremità dei canali per permettere alle cellule e al mezzo di fluire all'interno e all'esterno. Quello che farò è utilizzare questo strumento per riuscire a vedere i canali, dato che ho una superficie ampia e non riesco a individuare i pattern da solo, e poi forerò entrambe le estremità. Quindi effettuerò un foro grande qui, in modo da poter creare un serbatoio, mentre sull'altro lato praticherò un foro più piccolo per poter utilizzare tubicini in polietilene sull'altra estremità.

Siamo ora nella stanza di microfabbricazione e il prossimo passo consiste nell'unire le due superfici diverse che abbiamo. Per fare ciò, si utilizza questa macchina chiamata pulitrice al plasma e il processo è noto come trattamento al plasma. All'interno di questa camera si formerà un ambiente al plasma e, durante l'interazione tra il plasma e la superficie, il plasma romperà l'equilibrio superficiale debole e lo sostituirà con gruppi chimici altamente reattivi.

Quello che accadrà ora è che rimuoverò i nastri posizionati qui per prevenire la polvere e inserirò questi stampi all'interno della camera. Chiuderò completamente questa porta, prima l'alimentazione elettrica, poi la pompa, e a quel punto saremo pronti per iniziare. Riprenderemo tra cinque e dieci minuti.

Ora voglio spegnerlo, quindi spengo la pompa e l'alimentazione, poi aprirò la camera. In realtà qui c'è una pressione negativa, quindi potreste sentire un suono. È dovuto alla pressione negativa, quindi estraggo lentamente i miei stampi.

Dato che abbiamo entrambe le superfici con i pattern rivolte verso l'alto, prenderò lo strato inferiore, lo posizionerò nella mia mano sinistra e prenderò lo strato superiore, lo capovolgerò e lo posizionerò sopra le scanalature, quindi spingerò gli strati uno sull'altro. La resistenza e la permanenza dell'adesione sono i vantaggi offerti da questa macchina per il trattamento al plasma. Quello che vedete qui in questo momento è il canale nello strato superiore e i pattern scanalati nello strato inferiore, ed è pronto per il passaggio successivo.

E poi portare qui la stanza di coltura, il terreno di coltura e quindi aprire la piastra. Quindi possiamo semplicemente caricare la fibronectina, prelevare 60 microlitri di fibroina e caricarli nel dispositivo. Per generare un flusso all'interno del dispositivo e indurre un sottile rivestimento, vibrando all'interno del canale, possiamo semplicemente aspirare delicatamente dall'uscita.

Dopodiché, possiamo semplicemente posizionare questo dispositivo nell'incubatrice e lasciarlo per un'ora; dopo un'ora di raffreddamento all'interno dell'incubatrice con vibrazione. Estraiamo semplicemente il campione dall'incubatrice, quindi utilizziamo cinque ruggini, tre, tre fibre rugginose. Procediamo semplicemente con la fusione e questa ombreggiatura, quindi aggiungiamo il mezzo e successivamente eseguiamo anche il conteggio cellulare utilizzando il contatore cellulare.

Di solito utilizziamo circa un milione di cellule che si trovano all'interno del dispositivo. Pertanto, dopo la dissociazione, è sufficiente passare alcune volte il mezzo di lavaggio, quindi prelevare la sospensione cellulare ed infine caricare il canale per favorire un migliore carico cellulare all'interno del canale stesso. È possibile far fluire delicatamente utilizzando l'aspirazione.

Il mezzo sommato e la sospensione superficiale vengono aspirati attraverso la cella di uscita in genere automaticamente, consentendo, come si sa, l'impianto selettivo nel canale globale. Successivamente, possiamo semplicemente smontare e posizionare l'incubatrice per un'ora, fino a quando la cellula si sarà completamente diffusa all'interno del canale. Dopodiché, possiamo infondere l'annexina V e l'ioduro di propidio, nonché l'acqua ossigenata.

E poi studiare il saggio della vostra ipotesi temporale. Possiamo prelevare il campione all'interno di un alimento per colture cellulari e quindi preparare la soluzione con due millilitri di mezzo DMEM, nonché 20 microlitri di annessina V, 40 microlitri di ioduro di propidio e 100 millilitri di perossido di idrogeno. Quindi prelevare il mezzo di due millilitri con annessina V, ioduro di propidio e perossido di idrogeno, e poi inserire la siringa subito dopo.

Aggiungere i due millilitri di mezzo e 5 µL di ioduro di propidio, idroperossido. Possiamo semplicemente versare la soluzione all'interno delle camere di conteggio e quindi rimuovere le bolle d'aria, per poi collegare la C bear. Questa è una camera di conteggio Hamilton ermetica ai gas.

Questo è per tre orsi. Questo è un soffitto monouso. Questo è un ago da 27 gauge.

Questo è un tubo in polietilene PE 20. Dopo aver caricato la soluzione all'interno di una siringa, è sufficiente collegare il tubo, spingere completamente il pistone, spingere ancora e ripetere più volte; a volte è utile dare dei colpetti leggeri sulla siringa per rimuovere le bolle d'aria ed estrarre nuovamente la soluzione. Per chiarire, spingere completamente il pistone, rimuovere la bolla d'aria ed estrarre delicatamente la soluzione un'altra volta.

Prendere quindi la soluzione per un pasto, dopodiché possiamo commutare la valvola. Spingere, spingere la soluzione attraverso la valvola a tre vie e completamente all'interno del tubo. Alla fine la soluzione uscirà dalla punta del nostro tubo, dopodiché possiamo semplicemente collegare il tubo al microdispositivo e iniziare a infondere un microlitro al minuto.